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【摘要】 目的 通過检测心肌缺血再灌注损伤大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素6（IL6）含量以及显微镜观察心肌细胞病理学结构，探讨龙血竭总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。
方法 将40只SD大鼠随机分为4组：空白对照组（control组）、假手术组（sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注+龙血竭总黄酮干预组（SDFI/R组），每组10只。I/R组及SDFI/R组进行心肌缺血再灌注损伤造模。所有大鼠均在相应处理后通过腹主动脉采血留取血清标本，通过ELISA法测定TNFα和IL6含量;留取结扎梗死相应部位心肌组织进行HE染色，显微镜下观察其病理变化，并行qPCR检测心肌组织TNFα和IL6的mRNA含量。
结果 大鼠心肌组织病理HE染色示：I/R组的心肌肌纤维有大范围断裂，结构最为紊乱，炎症、水肿最明显;SDFI/R组心肌细胞排列较规整，断裂较少，组织间隙水肿较轻;control组及sham组差异不大，心肌组织无明显变性，心肌纤维排列基本规整，组织间隙水肿最轻，损伤最小。不同组间的TNFα、IL6水平比较差异均有统计学意义（P<0.01）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα、IL6水平均高于control组（P<0.05），SDFI/R组TNFα、IL6水平均低于I/R组（P<0.05）。不同组间的TNFα、IL6 mRNA 表达量比较差异均有统计学意义（P<0.001）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα、IL6 mRNA水平高于control组（P<0.05），SDFI/R组、I/R组的TNFα、IL6 mRNA水平高于sham组（P<0.05），SDFI/R组的TNFα、IL6 mRNA水平低于I/R组（P<0.05）。
结论 龙血竭总黄酮可减少心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中的炎症因子TNFα和IL6的释放，从而保护心肌细胞组织。
【关键词】 心肌缺血再灌注损伤;龙血竭总黄酮;TNFα;IL6
中图分类号：R542. 文献标志码： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.002
Effects of Sanguis Draconis flavones on serum inflammatory cytokines TNFα and IL6 in myocardial ischemiareperfusion injury rats
HUANG Biaohua1， 2， LIU Yan1， HUNAG Lansong1， 2， HUANG Zhaohe1▲
（1. Department of Cardiology of Affiliated Hospital， 2. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）
【Abstract】 Objective To discuss the influence of Sanguis Draconis flavones （SDF） on myocardial ischemiareperfusion injury （MIRI） by detecting the content of serum tumor necrosis factorα （TNFα） and interleukin6 （IL6） in MIRI rats， and by observing pathological structure of cardiomyocytes of them under microscope.
Methods 40 SD rats were randomly divided into four groups： control group， sham group， ischemiareperfusion（I/R）group， and I/R + Sanguis Draconis flavones （SDFI/R） group， with 10 rats in each group. MIRI models were made in the I/R group and the SDFI/R group. Blood sample were collected from the abdominal aorta， and their serum TNFα and IL6 were detected by ELISA. Finally， the rats were sacrificed and their hearts were immediately taken out， the corresponding myocardial tissues were ligated for HE staining， the pathological changes were observed under microscope， and the mRNA content of TNFα and IL6 in myocardial tissues were detected by qPCR.
Results Pathological HE staining of the myocardial tissue of rats showed that myocardial muscle fibers in the I/R group had a wide range of breakage， the most disordered structure， and the most obvious inflammation and edema. In the SDFI/R group， the arrangement of myocardial cells was more regular， the rupture was less， and the interstitial edema was milder. There was no significant difference between the control group and the sham group， no obvious degeneration of the myocardial tissue was found， the arrangement of myocardial fibers was basically regular， the intertissue edema was the mildest， and the injury was the least. Difference of the TNFα and IL6 levels among groups was statistically significant （P < 0.01）， the TNFα and IL6 levels of the sham group， the I/R group， and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P < 0.05）， and those in the SDFI/R group were lower than those in the I/R group （P <0.05）. There was statistically significant difference in TNFα and IL6 mRNA expression levels （P < 0.001）. The TNFα and IL6 mRNA levels of the sham group， the I/R group and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P <0.05）， those of the SDFI/R group and the I/R group were higher than those of the sham group （P < 0.05）， and those of the SDFI/R group were lower than those of the I/R group （P <0.05）. Conclusion SDF can reduce the release of inflammatory cytokines TNFα and IL6 in serum of rats with myocardial ischemiareperfusion injury， so as to protect myocardial tissue.
【Key words】 MIRI; SDF; TNFα; IL6
心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌在恢复血流再灌注后，反而加重其结构破坏，引起心肌细胞死亡，导致梗死范围扩大，造成心功能的进一步损害并影响急性心肌梗死（AMI）患者的预后[1]。MIRI是AMI再灌注治疗中最棘手的问题，严重影响AMI患者的预后，是当前国内外学者研究的热点。本实验拟建立大鼠在体MIRI模型，研究龙血竭总黄酮对MIRI大鼠炎症因子的影响;拟为探讨中药防治MIRI拓展新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SD大鼠40只，7～8个周龄，体重（250±20）g，雌雄各半，健康状况良好;由湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供（动物许可证号：SCXK〔湘〕20140011）;饲料由右江民族医学院动物实验中心提供;龙血竭粉剂由桂林三金制药研究所提供。TNFα 定量ELISA试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供;IL6定量ELISA试剂盒由欣博盛生物科技有限公司提供;实时定量PCR引物及试剂由武汉赛维尔生物科技有限公司提供。
1.2 分组和给药
将40只SD大鼠按随机数字表分为4组：空白对照组（control组）、假手术组（sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注+龙血竭总黄酮干预组（SDFI/R组），每组10只。control组不进行实验前干预;sham组、I/R组每组实验前分别给予0.9%生理盐水（10 mL/kg）灌胃;SDFI/R组每天予大鼠龙血竭总黄酮灌胃预处理（180 mg/kg）[2]。连续灌胃28天后开始实验造模。
1.3 实验动物造模[3～4]
第29天手术，术前禁食12小时。在10%水合氯醛（350 mg·mL-1）[5]腹腔注射麻醉下，仰位固定大鼠，四肢皮下连接标准导联心电图监测，前颈、胸备皮，切开颈前皮肤，钝性分离出气管，T型切开气管，连接气管插管后，连接小型动物用呼吸机（潮气量为20～30 mL·kg-1，频率70～80次·min-1）。在胸骨左缘旁0.3～0.5 cm处纵行切开第3～5肋 ， 小心剪开心包， 暴露心脏， 结扎冠状动脉左前降支，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，缺血心肌颜色较相邻区域变浅或变白，心电图监测显示进行性心肌缺血变化后Ⅱ导联ST段抬高证明造模成功，剪开缝扎线，进行再灌注120 min，造成MIRI模型[6]。假手术组的动物手术全过程与其他组相同，但只穿线不结扎冠脉，并在穿线后将心脏放回胸腔，适当闭合胸腔切口。空白对照组不进行手术。
1.4 检测各组TNFα和IL6含量
所有大鼠均在相应处理后通过腹主动脉采血并留取血清标本，严格按照ELISA方法规程步骤进行炎症因子TNFα和IL6含量检测，各组间进行对比。
1.5 镜下观察心肌细胞纤维的变化情况
同时采用腹腔动脉放血法处死大鼠后立即取出心脏，留取结扎相应部位心肌组织进行HE染色，镜下观察心肌细胞纤维的变化情况[7]。
1.6 检测心肌组织TNFα、IL6的mRNA表达量
对目标心肌组织行qPCR检测TNFα、IL6的mRNA表达量。
1.7 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用OneWay ANOVA方法进行统计分析，多组间两两比较采用SNK法，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 果
2.1 造模大鼠心电生理变化情况
观察Ⅱ导联的心电图改变，以造模30分钟ST段抬高与0分钟时比较超过2 mV，再灌注120 min 观察到高耸的T波下降或者已抬高的ST段下降1/2以上为造模成功（如图1）。
2.2 镜下观察各组大鼠心肌组织HE染色
通过阅片比较I/R组的心肌肌纤维有明显断裂，结构最为紊乱，心肌间隙炎症、水肿最明显，核周空泡最多，SDFI/R组与I/R组比较显示排列较规整，断裂较少，组织间隙水肿较轻，核周空泡形成较少;control组与sham组差异不大，心肌组织无明显变性，心肌纖维排列基本规整，组织间隙无明显水肿，未见明显损伤（见图2）。
2.3 检测血清学TNFα和IL6含量
经参照TNFα和IL6的ELISA试剂盒说明书，将已按浓度梯度稀释后待测样品，同标准品一起检测，检测出标准品OD值与浓度之间的标准曲线和相应公式（如图3、图4），将得到的在标准曲线范围待测样品OD值代入相应的标准曲线，再乘以相应稀释的比例，得出各待测样品的浓度。
不同组间的TNFα、IL6水平比较差异均有统计学意义（P<0.01）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα、IL6水平均高于control组（P<0.05），SDFI/R组TNFα、IL6水平均低于I/R组（P<0.05）。见表1。说明了sham组在相应的手术干预150 min的时长后仍出现了与创伤性相应的炎症反应。
2.4 qPCR检测TNFα、IL6的mRNA表达量
不同组间的TNFα mRNA、IL6 mRNA 表达量比较差异均有统计学意义（P<0.001）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于control组（P<0.05），SDFI/R组、I/R组的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于sham组（P<0.05），SDFI/R组的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平低于I/R组（P<0.05）。见表2。 3 论
《中国心血管病报告2018》指出，2016 年心血管病病死率仍居首位，高于肿瘤及其他疾病;中国城市和农村居民冠心病病死率继续保持2012 年以来的上升趋势，农村地区冠心病病死率上升趋势明显。最新欧洲心脏调查显示：欧洲每年有4万人死于心血管病，美国每年有90万人患AMI，其中22.5万人死亡。世界卫生组织“全球疾病负担研究”的统计数字预示，到2020年，中国每年因冠心病死亡的人数将有可能达到400万[8～9]。心肌缺血再灌注损伤的发病机制较复杂，氧化损伤、钙超载、炎性反应等众多路径及病理生理过程与之有关，而心肌缺血再灌注过程中创伤性炎症的发生与心肌缺血再灌注损伤密切相关[10]。TNFα是分子量为17 kDa的可溶性多肽，是一种单核因子（炎症因子），心肌的巨核细胞和单核细胞都可以合成产生TNFα，它具有广泛的生物学效应，参与炎症反应、介导休克、组织损伤的过程，也参与肿瘤细胞杀伤、调节细胞的增殖以及机体的免疫代谢等病理生理反应[11～12]。IL6是炎症风暴中一个重要的因子，也是一种多效的细胞因子，在炎症反应中起着调节作用;当炎症急性期时，其往往起着抗炎的作用，伴随着炎症的进展，IL6的这种抗炎作用逐步转成促炎效应，而出现对机体产生不利的影响。故IL6在急性心肌梗死过程中扮演着非常重要的角色，心肌坏死的面积与血浆中的IL6水平存在着正相关性[13]。
杨潇等人[14]对中医药治疗心肌缺血再灌注损伤的进展进行了总结，有用地黄多糖、栀子苷、复方参元丹等中药进行了相关的研究，结果提示近年来中药在防护心肌缺血再灌注损伤疾病方面具有独特优势，已成为研究热点。龙血竭为百合科植物剑叶龙血树 [Dracaena cochinchinensis （Lour.） S.C.Chen]的含脂木材经提取得到的树脂，主产于我国广西、海南、云南等地，史书上记载具有活血化瘀之功效，同时还有去腐生肌、止血等功效，目前临床上常用于敛疮生肌、外伤止血和治疗静脉炎等。张晓燕等[15]研究表明，龙血竭化学成分以及药理作用与进口血竭接近，其主要成分为黄酮类、苯丙素类、皂苷类、甾醇类、木脂素类和二苯乙烯类等。而既往有多方面的学者针对龙血竭的作用从多方面多领域进行了研究，近期林忆龙等[16]对龙血竭的药理研究表明，龙血竭具有抗炎、保护心血管、防辐射、抗纤维化、抑菌、促进创面愈合及保护中枢神经等药理作用。张鹏等人[17]在针对辐射所导致的神经炎的研究中发现龙血竭的干预在这一过程发生中缓解了氧化应激水平及相关的炎症因子的表达和线粒体的损伤程度;而张媛等人[18]在对皮肤病痤疮的治疗中也同时观察在动物模型上运用了龙血竭的中药干预后对TNFα、IL6的水平的调控作用，证实了龙血竭在抗炎方面所具备的功效。但龙血竭在心肌缺血再灌注损伤所导致的炎症风暴中的作用尚未见文献进行报道。结合实际诊治中龙血竭提取物作为临床治疗常用活血中药，有改善心肌缺血、抗血栓、抗炎、抗心律失常、调血脂等作用，特设计了本实验过程及设想。
本实验中，结扎了左前降支的大鼠心电图在30 min时出现了ST段较术前显著抬高、T波明显高耸，心电图提示出现心肌缺血的变化;再灌注120 mim时心电图ST段较结扎30 min时明显回落，T波下降超过1/3～1/2，说明左前降支恢复了血供，提示再灌注成功;有以上变化过程的心电图显示则表明造模成功。
大鼠目标心肌组织HE染色通过阅片比较各组结果，I/R组的结构最为紊乱，肌纤维有明显断裂，心肌核周空泡化、心肌间质水肿最明显;SDFI/R组与I/R对比，其心肌排列较规整，断裂较少，组织间隙水肿较轻;从病理组织层面上再证实了造模的效果，同时从不同组别结果的比较中，提示了龙血竭总黄酮的预干预对心肌细胞组织的有效保护作用。
血清学的检测研究结果显示，大鼠在创伤及心肌缺血再灌注时会释放TNFα、IL6，其检测结果与缺血再灌注后的损伤程度呈正相关，表明了心肌对损伤应激反应之一是合成并释放TNFα、IL6，而TNFα及IL6可诱导心肌细胞的凋亡[19]。本实验的研究结果显示，缺血再灌注组的血清TNFα、IL6含量明顯高于其他三组;假手术组的TNFα、IL6检测结果与正常对照组比较亦有升高，考虑假手术组在经历了颈部剥离气管插管、开胸暴露心脏、冠脉左前降支的穿线后的手术干预下30 min（对应梗死时间）+120 min（对应再灌注时间）观察期仍出现了可能与创伤性相关的炎症反应，但其炎症反应水平仍明显低于结扎了左前降支而出现心肌梗死的缺血再灌注组和缺血再灌注+龙血竭总黄酮干预组;与缺血再灌注组比较，龙血竭总黄酮干预组的炎症指标TNFα、IL6含量明显减少，提示在心肌缺血再灌注损伤的发生过程中，龙血竭总黄酮的干预可减少TNFα、IL6的释放。实时定量PCR检测TNFα、IL6的mRNA表达量的结果显示，I/R组、SDFI/R组TNFα和IL6的mRNA表达量均有上升，而SDFI/R组的表达与I/R组表达比较有下调。同时证实了心肌缺血再灌注组损伤的大鼠诱发了炎症反应过程，释放了大量的肿瘤炎症因子，其中就有TNFα与IL6;而龙血竭总黄酮的干预能抑制TNFα、IL6的释放，结合病理读片的结果，这种干预机制保护了心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌细胞组织。但其干预的机制尚未能明确，是否调控了肿瘤炎症因子TNFα、IL6的上游某个通路，或是对相应下游的通路进行抑制，从而使得机体内的肿瘤炎症因子的释放或者表达量下降。
既往的研究已表明，HIF可以通过诱导缺血预适应发挥心脏保护作用。缺氧诱导因子2α（Hypoxiainducible factor 2alpha，HIF2α）亚基是调节缺氧诱导因子（Hypoxiainducible factor 2，HIF2）活性的功能亚单位。韩永丽等[20]在探讨电针内关预处理对心肌缺血再灌注大鼠炎性因子TNFα、IL1β与MKK3/6p38MAPK通路的影响实验中，得出了p38MAPK信号通路介导了电针内关预处理对I/R大鼠心肌组织的保护作用，并且上游激活物包括参与炎症反应和氧化应激反应的各类相关细胞因子，参与I/R的保护效应的结论。在这个过程中，TNFα作为p38MAPK信号通路上游激活物的炎症反应因子。沈诚等人[21]曾在离体的心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏对JAK/STAT通路进行研究，他们团队通过使用JAK抑制剂AG490，STAT抑制剂RMP，对通路蛋白进行干预，从而得出了抑制JAK/STAT通路的活化可下调心肌组织TNFα和IL6的表达，这可能有助于减轻缺血再灌注所致心肌损伤的结论。但这种通过抑制剂干预方式在临床上大范围的开展应用具有一定的难度，所以进行中医药的干预研究，是一个有意义和价值的探讨方向。而龙血竭总黄酮是否会通过以上类似通路对心肌缺血再灌注损伤进行调控保护，仍需要进一步的实验来发现与证明，因此深入而系统地进行研究十分必要。 参 考 文 献
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（收稿日期：2020-12-03 修回日期：2021-05-31）
（编辑：梁明佩）
方法 将40只SD大鼠随机分为4组：空白对照组（control组）、假手术组（sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注+龙血竭总黄酮干预组（SDFI/R组），每组10只。I/R组及SDFI/R组进行心肌缺血再灌注损伤造模。所有大鼠均在相应处理后通过腹主动脉采血留取血清标本，通过ELISA法测定TNFα和IL6含量;留取结扎梗死相应部位心肌组织进行HE染色，显微镜下观察其病理变化，并行qPCR检测心肌组织TNFα和IL6的mRNA含量。
结果 大鼠心肌组织病理HE染色示：I/R组的心肌肌纤维有大范围断裂，结构最为紊乱，炎症、水肿最明显;SDFI/R组心肌细胞排列较规整，断裂较少，组织间隙水肿较轻;control组及sham组差异不大，心肌组织无明显变性，心肌纤维排列基本规整，组织间隙水肿最轻，损伤最小。不同组间的TNFα、IL6水平比较差异均有统计学意义（P<0.01）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα、IL6水平均高于control组（P<0.05），SDFI/R组TNFα、IL6水平均低于I/R组（P<0.05）。不同组间的TNFα、IL6 mRNA 表达量比较差异均有统计学意义（P<0.001）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα、IL6 mRNA水平高于control组（P<0.05），SDFI/R组、I/R组的TNFα、IL6 mRNA水平高于sham组（P<0.05），SDFI/R组的TNFα、IL6 mRNA水平低于I/R组（P<0.05）。
结论 龙血竭总黄酮可减少心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中的炎症因子TNFα和IL6的释放，从而保护心肌细胞组织。
【关键词】 心肌缺血再灌注损伤;龙血竭总黄酮;TNFα;IL6
中图分类号：R542. 文献标志码： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.002
Effects of Sanguis Draconis flavones on serum inflammatory cytokines TNFα and IL6 in myocardial ischemiareperfusion injury rats
HUANG Biaohua1， 2， LIU Yan1， HUNAG Lansong1， 2， HUANG Zhaohe1▲
（1. Department of Cardiology of Affiliated Hospital， 2. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）
【Abstract】 Objective To discuss the influence of Sanguis Draconis flavones （SDF） on myocardial ischemiareperfusion injury （MIRI） by detecting the content of serum tumor necrosis factorα （TNFα） and interleukin6 （IL6） in MIRI rats， and by observing pathological structure of cardiomyocytes of them under microscope.
Methods 40 SD rats were randomly divided into four groups： control group， sham group， ischemiareperfusion（I/R）group， and I/R + Sanguis Draconis flavones （SDFI/R） group， with 10 rats in each group. MIRI models were made in the I/R group and the SDFI/R group. Blood sample were collected from the abdominal aorta， and their serum TNFα and IL6 were detected by ELISA. Finally， the rats were sacrificed and their hearts were immediately taken out， the corresponding myocardial tissues were ligated for HE staining， the pathological changes were observed under microscope， and the mRNA content of TNFα and IL6 in myocardial tissues were detected by qPCR.
Results Pathological HE staining of the myocardial tissue of rats showed that myocardial muscle fibers in the I/R group had a wide range of breakage， the most disordered structure， and the most obvious inflammation and edema. In the SDFI/R group， the arrangement of myocardial cells was more regular， the rupture was less， and the interstitial edema was milder. There was no significant difference between the control group and the sham group， no obvious degeneration of the myocardial tissue was found， the arrangement of myocardial fibers was basically regular， the intertissue edema was the mildest， and the injury was the least. Difference of the TNFα and IL6 levels among groups was statistically significant （P < 0.01）， the TNFα and IL6 levels of the sham group， the I/R group， and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P < 0.05）， and those in the SDFI/R group were lower than those in the I/R group （P <0.05）. There was statistically significant difference in TNFα and IL6 mRNA expression levels （P < 0.001）. The TNFα and IL6 mRNA levels of the sham group， the I/R group and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P <0.05）， those of the SDFI/R group and the I/R group were higher than those of the sham group （P < 0.05）， and those of the SDFI/R group were lower than those of the I/R group （P <0.05）. Conclusion SDF can reduce the release of inflammatory cytokines TNFα and IL6 in serum of rats with myocardial ischemiareperfusion injury， so as to protect myocardial tissue.
【Key words】 MIRI; SDF; TNFα; IL6
心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌在恢复血流再灌注后，反而加重其结构破坏，引起心肌细胞死亡，导致梗死范围扩大，造成心功能的进一步损害并影响急性心肌梗死（AMI）患者的预后[1]。MIRI是AMI再灌注治疗中最棘手的问题，严重影响AMI患者的预后，是当前国内外学者研究的热点。本实验拟建立大鼠在体MIRI模型，研究龙血竭总黄酮对MIRI大鼠炎症因子的影响;拟为探讨中药防治MIRI拓展新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SD大鼠40只，7～8个周龄，体重（250±20）g，雌雄各半，健康状况良好;由湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供（动物许可证号：SCXK〔湘〕20140011）;饲料由右江民族医学院动物实验中心提供;龙血竭粉剂由桂林三金制药研究所提供。TNFα 定量ELISA试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供;IL6定量ELISA试剂盒由欣博盛生物科技有限公司提供;实时定量PCR引物及试剂由武汉赛维尔生物科技有限公司提供。
1.2 分组和给药
将40只SD大鼠按随机数字表分为4组：空白对照组（control组）、假手术组（sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注+龙血竭总黄酮干预组（SDFI/R组），每组10只。control组不进行实验前干预;sham组、I/R组每组实验前分别给予0.9%生理盐水（10 mL/kg）灌胃;SDFI/R组每天予大鼠龙血竭总黄酮灌胃预处理（180 mg/kg）[2]。连续灌胃28天后开始实验造模。
1.3 实验动物造模[3～4]
第29天手术，术前禁食12小时。在10%水合氯醛（350 mg·mL-1）[5]腹腔注射麻醉下，仰位固定大鼠，四肢皮下连接标准导联心电图监测，前颈、胸备皮，切开颈前皮肤，钝性分离出气管，T型切开气管，连接气管插管后，连接小型动物用呼吸机（潮气量为20～30 mL·kg-1，频率70～80次·min-1）。在胸骨左缘旁0.3～0.5 cm处纵行切开第3～5肋 ， 小心剪开心包， 暴露心脏， 结扎冠状动脉左前降支，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，缺血心肌颜色较相邻区域变浅或变白，心电图监测显示进行性心肌缺血变化后Ⅱ导联ST段抬高证明造模成功，剪开缝扎线，进行再灌注120 min，造成MIRI模型[6]。假手术组的动物手术全过程与其他组相同，但只穿线不结扎冠脉，并在穿线后将心脏放回胸腔，适当闭合胸腔切口。空白对照组不进行手术。
1.4 检测各组TNFα和IL6含量
所有大鼠均在相应处理后通过腹主动脉采血并留取血清标本，严格按照ELISA方法规程步骤进行炎症因子TNFα和IL6含量检测，各组间进行对比。
1.5 镜下观察心肌细胞纤维的变化情况
同时采用腹腔动脉放血法处死大鼠后立即取出心脏，留取结扎相应部位心肌组织进行HE染色，镜下观察心肌细胞纤维的变化情况[7]。
1.6 检测心肌组织TNFα、IL6的mRNA表达量
对目标心肌组织行qPCR检测TNFα、IL6的mRNA表达量。
1.7 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用OneWay ANOVA方法进行统计分析，多组间两两比较采用SNK法，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 果
2.1 造模大鼠心电生理变化情况
观察Ⅱ导联的心电图改变，以造模30分钟ST段抬高与0分钟时比较超过2 mV，再灌注120 min 观察到高耸的T波下降或者已抬高的ST段下降1/2以上为造模成功（如图1）。
2.2 镜下观察各组大鼠心肌组织HE染色
通过阅片比较I/R组的心肌肌纤维有明显断裂，结构最为紊乱，心肌间隙炎症、水肿最明显，核周空泡最多，SDFI/R组与I/R组比较显示排列较规整，断裂较少，组织间隙水肿较轻，核周空泡形成较少;control组与sham组差异不大，心肌组织无明显变性，心肌纖维排列基本规整，组织间隙无明显水肿，未见明显损伤（见图2）。
2.3 检测血清学TNFα和IL6含量
经参照TNFα和IL6的ELISA试剂盒说明书，将已按浓度梯度稀释后待测样品，同标准品一起检测，检测出标准品OD值与浓度之间的标准曲线和相应公式（如图3、图4），将得到的在标准曲线范围待测样品OD值代入相应的标准曲线，再乘以相应稀释的比例，得出各待测样品的浓度。
不同组间的TNFα、IL6水平比较差异均有统计学意义（P<0.01）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα、IL6水平均高于control组（P<0.05），SDFI/R组TNFα、IL6水平均低于I/R组（P<0.05）。见表1。说明了sham组在相应的手术干预150 min的时长后仍出现了与创伤性相应的炎症反应。
2.4 qPCR检测TNFα、IL6的mRNA表达量
不同组间的TNFα mRNA、IL6 mRNA 表达量比较差异均有统计学意义（P<0.001）;sham组、I/R组及SDFI/R组的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于control组（P<0.05），SDFI/R组、I/R组的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于sham组（P<0.05），SDFI/R组的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平低于I/R组（P<0.05）。见表2。 3 论
《中国心血管病报告2018》指出，2016 年心血管病病死率仍居首位，高于肿瘤及其他疾病;中国城市和农村居民冠心病病死率继续保持2012 年以来的上升趋势，农村地区冠心病病死率上升趋势明显。最新欧洲心脏调查显示：欧洲每年有4万人死于心血管病，美国每年有90万人患AMI，其中22.5万人死亡。世界卫生组织“全球疾病负担研究”的统计数字预示，到2020年，中国每年因冠心病死亡的人数将有可能达到400万[8～9]。心肌缺血再灌注损伤的发病机制较复杂，氧化损伤、钙超载、炎性反应等众多路径及病理生理过程与之有关，而心肌缺血再灌注过程中创伤性炎症的发生与心肌缺血再灌注损伤密切相关[10]。TNFα是分子量为17 kDa的可溶性多肽，是一种单核因子（炎症因子），心肌的巨核细胞和单核细胞都可以合成产生TNFα，它具有广泛的生物学效应，参与炎症反应、介导休克、组织损伤的过程，也参与肿瘤细胞杀伤、调节细胞的增殖以及机体的免疫代谢等病理生理反应[11～12]。IL6是炎症风暴中一个重要的因子，也是一种多效的细胞因子，在炎症反应中起着调节作用;当炎症急性期时，其往往起着抗炎的作用，伴随着炎症的进展，IL6的这种抗炎作用逐步转成促炎效应，而出现对机体产生不利的影响。故IL6在急性心肌梗死过程中扮演着非常重要的角色，心肌坏死的面积与血浆中的IL6水平存在着正相关性[13]。
杨潇等人[14]对中医药治疗心肌缺血再灌注损伤的进展进行了总结，有用地黄多糖、栀子苷、复方参元丹等中药进行了相关的研究，结果提示近年来中药在防护心肌缺血再灌注损伤疾病方面具有独特优势，已成为研究热点。龙血竭为百合科植物剑叶龙血树 [Dracaena cochinchinensis （Lour.） S.C.Chen]的含脂木材经提取得到的树脂，主产于我国广西、海南、云南等地，史书上记载具有活血化瘀之功效，同时还有去腐生肌、止血等功效，目前临床上常用于敛疮生肌、外伤止血和治疗静脉炎等。张晓燕等[15]研究表明，龙血竭化学成分以及药理作用与进口血竭接近，其主要成分为黄酮类、苯丙素类、皂苷类、甾醇类、木脂素类和二苯乙烯类等。而既往有多方面的学者针对龙血竭的作用从多方面多领域进行了研究，近期林忆龙等[16]对龙血竭的药理研究表明，龙血竭具有抗炎、保护心血管、防辐射、抗纤维化、抑菌、促进创面愈合及保护中枢神经等药理作用。张鹏等人[17]在针对辐射所导致的神经炎的研究中发现龙血竭的干预在这一过程发生中缓解了氧化应激水平及相关的炎症因子的表达和线粒体的损伤程度;而张媛等人[18]在对皮肤病痤疮的治疗中也同时观察在动物模型上运用了龙血竭的中药干预后对TNFα、IL6的水平的调控作用，证实了龙血竭在抗炎方面所具备的功效。但龙血竭在心肌缺血再灌注损伤所导致的炎症风暴中的作用尚未见文献进行报道。结合实际诊治中龙血竭提取物作为临床治疗常用活血中药，有改善心肌缺血、抗血栓、抗炎、抗心律失常、调血脂等作用，特设计了本实验过程及设想。
本实验中，结扎了左前降支的大鼠心电图在30 min时出现了ST段较术前显著抬高、T波明显高耸，心电图提示出现心肌缺血的变化;再灌注120 mim时心电图ST段较结扎30 min时明显回落，T波下降超过1/3～1/2，说明左前降支恢复了血供，提示再灌注成功;有以上变化过程的心电图显示则表明造模成功。
大鼠目标心肌组织HE染色通过阅片比较各组结果，I/R组的结构最为紊乱，肌纤维有明显断裂，心肌核周空泡化、心肌间质水肿最明显;SDFI/R组与I/R对比，其心肌排列较规整，断裂较少，组织间隙水肿较轻;从病理组织层面上再证实了造模的效果，同时从不同组别结果的比较中，提示了龙血竭总黄酮的预干预对心肌细胞组织的有效保护作用。
血清学的检测研究结果显示，大鼠在创伤及心肌缺血再灌注时会释放TNFα、IL6，其检测结果与缺血再灌注后的损伤程度呈正相关，表明了心肌对损伤应激反应之一是合成并释放TNFα、IL6，而TNFα及IL6可诱导心肌细胞的凋亡[19]。本实验的研究结果显示，缺血再灌注组的血清TNFα、IL6含量明顯高于其他三组;假手术组的TNFα、IL6检测结果与正常对照组比较亦有升高，考虑假手术组在经历了颈部剥离气管插管、开胸暴露心脏、冠脉左前降支的穿线后的手术干预下30 min（对应梗死时间）+120 min（对应再灌注时间）观察期仍出现了可能与创伤性相关的炎症反应，但其炎症反应水平仍明显低于结扎了左前降支而出现心肌梗死的缺血再灌注组和缺血再灌注+龙血竭总黄酮干预组;与缺血再灌注组比较，龙血竭总黄酮干预组的炎症指标TNFα、IL6含量明显减少，提示在心肌缺血再灌注损伤的发生过程中，龙血竭总黄酮的干预可减少TNFα、IL6的释放。实时定量PCR检测TNFα、IL6的mRNA表达量的结果显示，I/R组、SDFI/R组TNFα和IL6的mRNA表达量均有上升，而SDFI/R组的表达与I/R组表达比较有下调。同时证实了心肌缺血再灌注组损伤的大鼠诱发了炎症反应过程，释放了大量的肿瘤炎症因子，其中就有TNFα与IL6;而龙血竭总黄酮的干预能抑制TNFα、IL6的释放，结合病理读片的结果，这种干预机制保护了心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌细胞组织。但其干预的机制尚未能明确，是否调控了肿瘤炎症因子TNFα、IL6的上游某个通路，或是对相应下游的通路进行抑制，从而使得机体内的肿瘤炎症因子的释放或者表达量下降。
既往的研究已表明，HIF可以通过诱导缺血预适应发挥心脏保护作用。缺氧诱导因子2α（Hypoxiainducible factor 2alpha，HIF2α）亚基是调节缺氧诱导因子（Hypoxiainducible factor 2，HIF2）活性的功能亚单位。韩永丽等[20]在探讨电针内关预处理对心肌缺血再灌注大鼠炎性因子TNFα、IL1β与MKK3/6p38MAPK通路的影响实验中，得出了p38MAPK信号通路介导了电针内关预处理对I/R大鼠心肌组织的保护作用，并且上游激活物包括参与炎症反应和氧化应激反应的各类相关细胞因子，参与I/R的保护效应的结论。在这个过程中，TNFα作为p38MAPK信号通路上游激活物的炎症反应因子。沈诚等人[21]曾在离体的心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏对JAK/STAT通路进行研究，他们团队通过使用JAK抑制剂AG490，STAT抑制剂RMP，对通路蛋白进行干预，从而得出了抑制JAK/STAT通路的活化可下调心肌组织TNFα和IL6的表达，这可能有助于减轻缺血再灌注所致心肌损伤的结论。但这种通过抑制剂干预方式在临床上大范围的开展应用具有一定的难度，所以进行中医药的干预研究，是一个有意义和价值的探讨方向。而龙血竭总黄酮是否会通过以上类似通路对心肌缺血再灌注损伤进行调控保护，仍需要进一步的实验来发现与证明，因此深入而系统地进行研究十分必要。 参 考 文 献
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（收稿日期：2020-12-03 修回日期：2021-05-31）
（编辑：梁明佩）