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[摘要] 目的 建立氯达软膏、利唑软膏、硫磺软膏医院软膏剂微生物限度检查方法。 方法 按《中国药典》2010年版二部微生物限度检查法中对细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查法进行验证。 结果 氯达软膏和利唑软膏细菌、霉菌及酵母菌计数检查采用薄膜过滤法，控制菌检查均采用薄膜过滤法；硫磺软膏细菌、霉菌及酵母菌计数检查采用培养基稀释法，控制菌金黄色葡萄球菌检查采用培养基稀释法，铜绿假单胞菌检查采用常规法。 结论 医院软膏制剂必须通过方法验证试验建立合理的检验方法，以保证检验结果的准确性。
[关键词] 微生物限度；方法验证；回收率； 医院制剂；软膏
[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）12-105-03
氯达软膏、利唑软膏、硫磺软膏作为梅县慢性病防治院常用的医生处方药，在临床被广泛应用，原质量标准无微生物限度检查方法学验证，为控制产品质量，确保安全用药，本文按照《中国药典》2010年版二部规定[1]进行微生物方法学验证。根据制剂抑菌活性的强弱和对不同菌种抑菌程度的大小选择适当的检查方法，加入5种验证试验菌株：枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球、白色念珠菌、黑曲霉菌于氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏中，对各试验菌的回收率进行验证，建立氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏细菌、霉菌及酵母菌检出方法；控制菌以加入2种验证试验菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行检出实验，建立氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏控制菌检查方法。
1 试药与仪器
1.1 试验样品
氯达软膏（批号分别为130629，130712，130718；利唑软膏（批号分别为13720，130625，130723），硫磺软膏（批号分别为130610，130615，130623）均由梅县慢性病防治院提供。
1.2 验证用仪器
电热恒温鼓风干燥箱、BSC-1300ⅡA2生物安全柜、DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温培养箱、HCB602H电子分析天平（0.01g）、ZW-808A微型智能集菌仪、一次性无菌过滤器、ZW-808D智能匀浆仪、卧式灭菌器、HH.Bll.500-电热恒温培养箱、SPX-150型生化培养箱等
1.3 试验菌株
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501-2a1]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003-5a]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102-3a]、白色念珠菌[CMCC（F）98001-3a]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104-2a]黑曲霉[CMCC（F）98003-1a]均由中国食品药品检定研究院提供，以上菌株传代次数均不超过5代。
1.4 验证用培养基及稀释剂
pH=7.0的氯化钠一蛋白胨缓冲液（批号：1112292）、营养肉汤培养基（批号：3101032）、营养琼脂培养基（批号：201112262）、改良马丁培养基（批号：3101466）、改良马丁琼脂培养基（批号：3101223）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：201112231）、胆盐乳糖培养基（批号：3101078）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：120315），溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：110223）均由北京三药科技开发公司或广东环凯微生物有限公司出品。其他试剂均为分析纯或化学纯。
2 方法与结果
2.1 菌液制备[1-12]
接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养温度（34±1）℃，培养24h，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养温度（25±1）℃，培养46h，将上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1毫升含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养温度（25±1）℃，培养6d，加入4mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1毫升含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
2.2 供试品溶液制备[1-12]
氯达软膏、利唑软膏供试液：取氯达软膏10.12g、利唑软膏9.95g，分别加至含20mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的二个三角瓶中，充分振摇使供试品溶解后，各加入45℃的pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100mL，振摇6min，静置使油水明显分层，取其水层，作为1∶10的供试液。
硫磺软膏供试液：取硫磺软膏5.05g，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，加入45℃ 的pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1︰20的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数验证[1-12]
试验组：取按“2.2”项下制备的供试品溶液1mL和试验菌液1mL按常规法：取供试液1mL注皿；培养基稀释法：取供试品溶液1mL注入10个平皿（0.1mL/皿）；离心法：取一定量的供试品溶液，以500 r/min离心5min，取上清液试验；薄膜过滤法：取供试品溶液1mL，采用薄膜过滤法，依法检查，以pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液为冲洗液。
菌液组：取1mL试验组中相同稀释级的菌悬液，同法测定其菌数，得出试验组中加入的菌数。每株试验菌平行制备2个平皿，计算平均菌落数。
供试品对照组：取与试验组同一供试品溶液和方法，不加菌液，测定样品本底菌。
稀释剂对照组：用pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液替代供试品，加入试验菌，按试验组的方法测定其菌落数。 计算公式：
结果判断：稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于70%，若3次独立平行试验中试验组的菌数回收率均不低于70%，则说明可照该供试品溶液制备方法和计数方法测定该供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，则说明所采用的方法不可行，应改用其他方法（离心法、中和法、薄膜过滤法等）消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。验证试验结果见表1（表中薄膜过滤法：冲洗量为100mL×3次。）
上表试验结果表明，3个样品中的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌3个菌株回收率试验，氯达软膏、利唑软膏抑菌作用较强，需采用离心法+薄膜过滤法联用消除供试品的抑菌活性；而硫磺软膏则用培养基稀释法0.1mL/皿，回收率能达到70%以上；氯达软膏、利唑软膏白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验需用离心法+薄膜过滤法联用、硫磺软膏用培养基稀释法（0.1mL/皿）回收率才能达到70%以上。
2.4 控制菌检查法的验证
试验组： 取 “2.2”项下制备的供试品溶液10mL和50～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。
阴性对照组： 除菌液为大肠埃希氏菌1mL（10～100cfu），方法同试验组。
上表试验结果表明，氯达软膏与利唑软膏因其抑菌作用较强，只能采用离心法+薄膜过滤法检查金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌；硫磺软膏用培养基稀释法检查金黄色葡萄球菌（200mL）及常规法检查铜绿假单胞菌。
3 讨论
上述细菌、霉菌及酵母菌计数验证及控制菌检查法的验证数据表明，3种医院外用软膏制剂均不能按常规法检查微生物限度， 抑菌作用较强的品种氯达软膏和利唑软膏需要采用离心法+薄膜过滤法进行微生物限度检查，而硫磺软膏则用培养基稀释法可进行微生物限度检查。
软膏剂供试品的制备一直比较繁琐，笔者采用中国药典规定非水溶性供试品的两种制备方法，发现平皿法测定供试品时，用药典规定的方法1更适合；方法2的十四烷酸异丙酯容易与一次性塑料培养皿发生反应，使培养皿表面变白，难以计数。因此，在2.2 供试品溶液制备中采用了两种供试品溶液制备方法。
采用药典规定非水溶性供试品的方法2时，如供试品难溶，可尝试用匀浆仪低速档混溶，在供试品的冲洗液中加入1%无菌聚山梨酯80[13]，可以明显减少薄膜上药物的残留，使计数更准确。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录107-116.
[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-382.
[3] 宾驰，颜栋林.4种医院制剂微生物限度检查方法验证[J].中国医药指南，2011，9（22）：226-227.
[4] 钟国庆，刘大伟.21种医院外用制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国药品标准，2010，11（6）：461-463，476 .
[5] 钟国庆，刘大伟，刘华，等.26种医院外用制剂微生物限度检查方法的建立[J].中国药品标准，2011，12（4）：307-310.
[6] 黄璐敏，刘杜妙，徐文英，等.2种医院软膏制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国药业，2012，21（18）：47-49.
[7] 李晓东，李娟，郭朝晖，等.几种医院外用中药制剂微生物限度检查方法的建立[J].西部中医药，2012，25（2）：25-27.
[8] 黄依玲.医院制剂微生物限度检查方法的重新验证[J].中国现代药物应用，2013，7（9）：3-4.
[9] 柳冬梅，殷生楠.10种医院制剂微生物限度检查法验证[J].医学理论与实践，2010，23（1）：1-3.
[10] 卢文斌，郭瑜蓉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度检查方法学验证[J].海峡药学，2009，21（9）：48-49.
[11] 游龙.诺氟沙星胶囊微生物限度检测方法的验证[J].海峡药学，2010，22（12）：77-78.
[12] 张静华.食品的微生物限度检验方法验证的研究初探[J].中国民族民间医药，2012，21（12）：58-59，61.
[13] 张玉兰，林宣伟.联苯苄唑乳膏微生物限度检查方法的验证[J].今日药学，2010，20（3）：14-16.
（收稿日期：2014-03-13）
[关键词] 微生物限度；方法验证；回收率； 医院制剂；软膏
[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）12-105-03
氯达软膏、利唑软膏、硫磺软膏作为梅县慢性病防治院常用的医生处方药，在临床被广泛应用，原质量标准无微生物限度检查方法学验证，为控制产品质量，确保安全用药，本文按照《中国药典》2010年版二部规定[1]进行微生物方法学验证。根据制剂抑菌活性的强弱和对不同菌种抑菌程度的大小选择适当的检查方法，加入5种验证试验菌株：枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球、白色念珠菌、黑曲霉菌于氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏中，对各试验菌的回收率进行验证，建立氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏细菌、霉菌及酵母菌检出方法；控制菌以加入2种验证试验菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行检出实验，建立氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏控制菌检查方法。
1 试药与仪器
1.1 试验样品
氯达软膏（批号分别为130629，130712，130718；利唑软膏（批号分别为13720，130625，130723），硫磺软膏（批号分别为130610，130615，130623）均由梅县慢性病防治院提供。
1.2 验证用仪器
电热恒温鼓风干燥箱、BSC-1300ⅡA2生物安全柜、DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温培养箱、HCB602H电子分析天平（0.01g）、ZW-808A微型智能集菌仪、一次性无菌过滤器、ZW-808D智能匀浆仪、卧式灭菌器、HH.Bll.500-电热恒温培养箱、SPX-150型生化培养箱等
1.3 试验菌株
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501-2a1]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003-5a]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102-3a]、白色念珠菌[CMCC（F）98001-3a]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104-2a]黑曲霉[CMCC（F）98003-1a]均由中国食品药品检定研究院提供，以上菌株传代次数均不超过5代。
1.4 验证用培养基及稀释剂
pH=7.0的氯化钠一蛋白胨缓冲液（批号：1112292）、营养肉汤培养基（批号：3101032）、营养琼脂培养基（批号：201112262）、改良马丁培养基（批号：3101466）、改良马丁琼脂培养基（批号：3101223）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：201112231）、胆盐乳糖培养基（批号：3101078）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：120315），溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：110223）均由北京三药科技开发公司或广东环凯微生物有限公司出品。其他试剂均为分析纯或化学纯。
2 方法与结果
2.1 菌液制备[1-12]
接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养温度（34±1）℃，培养24h，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养温度（25±1）℃，培养46h，将上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1毫升含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养温度（25±1）℃，培养6d，加入4mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1毫升含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
2.2 供试品溶液制备[1-12]
氯达软膏、利唑软膏供试液：取氯达软膏10.12g、利唑软膏9.95g，分别加至含20mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的二个三角瓶中，充分振摇使供试品溶解后，各加入45℃的pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100mL，振摇6min，静置使油水明显分层，取其水层，作为1∶10的供试液。
硫磺软膏供试液：取硫磺软膏5.05g，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，加入45℃ 的pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1︰20的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数验证[1-12]
试验组：取按“2.2”项下制备的供试品溶液1mL和试验菌液1mL按常规法：取供试液1mL注皿；培养基稀释法：取供试品溶液1mL注入10个平皿（0.1mL/皿）；离心法：取一定量的供试品溶液，以500 r/min离心5min，取上清液试验；薄膜过滤法：取供试品溶液1mL，采用薄膜过滤法，依法检查，以pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液为冲洗液。
菌液组：取1mL试验组中相同稀释级的菌悬液，同法测定其菌数，得出试验组中加入的菌数。每株试验菌平行制备2个平皿，计算平均菌落数。
供试品对照组：取与试验组同一供试品溶液和方法，不加菌液，测定样品本底菌。
稀释剂对照组：用pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液替代供试品，加入试验菌，按试验组的方法测定其菌落数。 计算公式：
结果判断：稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于70%，若3次独立平行试验中试验组的菌数回收率均不低于70%，则说明可照该供试品溶液制备方法和计数方法测定该供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，则说明所采用的方法不可行，应改用其他方法（离心法、中和法、薄膜过滤法等）消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。验证试验结果见表1（表中薄膜过滤法：冲洗量为100mL×3次。）
上表试验结果表明，3个样品中的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌3个菌株回收率试验，氯达软膏、利唑软膏抑菌作用较强，需采用离心法+薄膜过滤法联用消除供试品的抑菌活性；而硫磺软膏则用培养基稀释法0.1mL/皿，回收率能达到70%以上；氯达软膏、利唑软膏白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验需用离心法+薄膜过滤法联用、硫磺软膏用培养基稀释法（0.1mL/皿）回收率才能达到70%以上。
2.4 控制菌检查法的验证
试验组： 取 “2.2”项下制备的供试品溶液10mL和50～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。
阴性对照组： 除菌液为大肠埃希氏菌1mL（10～100cfu），方法同试验组。
上表试验结果表明，氯达软膏与利唑软膏因其抑菌作用较强，只能采用离心法+薄膜过滤法检查金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌；硫磺软膏用培养基稀释法检查金黄色葡萄球菌（200mL）及常规法检查铜绿假单胞菌。
3 讨论
上述细菌、霉菌及酵母菌计数验证及控制菌检查法的验证数据表明，3种医院外用软膏制剂均不能按常规法检查微生物限度， 抑菌作用较强的品种氯达软膏和利唑软膏需要采用离心法+薄膜过滤法进行微生物限度检查，而硫磺软膏则用培养基稀释法可进行微生物限度检查。
软膏剂供试品的制备一直比较繁琐，笔者采用中国药典规定非水溶性供试品的两种制备方法，发现平皿法测定供试品时，用药典规定的方法1更适合；方法2的十四烷酸异丙酯容易与一次性塑料培养皿发生反应，使培养皿表面变白，难以计数。因此，在2.2 供试品溶液制备中采用了两种供试品溶液制备方法。
采用药典规定非水溶性供试品的方法2时，如供试品难溶，可尝试用匀浆仪低速档混溶，在供试品的冲洗液中加入1%无菌聚山梨酯80[13]，可以明显减少薄膜上药物的残留，使计数更准确。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录107-116.
[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-382.
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[4] 钟国庆，刘大伟.21种医院外用制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国药品标准，2010，11（6）：461-463，476 .
[5] 钟国庆，刘大伟，刘华，等.26种医院外用制剂微生物限度检查方法的建立[J].中国药品标准，2011，12（4）：307-310.
[6] 黄璐敏，刘杜妙，徐文英，等.2种医院软膏制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国药业，2012，21（18）：47-49.
[7] 李晓东，李娟，郭朝晖，等.几种医院外用中药制剂微生物限度检查方法的建立[J].西部中医药，2012，25（2）：25-27.
[8] 黄依玲.医院制剂微生物限度检查方法的重新验证[J].中国现代药物应用，2013，7（9）：3-4.
[9] 柳冬梅，殷生楠.10种医院制剂微生物限度检查法验证[J].医学理论与实践，2010，23（1）：1-3.
[10] 卢文斌，郭瑜蓉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度检查方法学验证[J].海峡药学，2009，21（9）：48-49.
[11] 游龙.诺氟沙星胶囊微生物限度检测方法的验证[J].海峡药学，2010，22（12）：77-78.
[12] 张静华.食品的微生物限度检验方法验证的研究初探[J].中国民族民间医药，2012，21（12）：58-59，61.
[13] 张玉兰，林宣伟.联苯苄唑乳膏微生物限度检查方法的验证[J].今日药学，2010，20（3）：14-16.
（收稿日期：2014-03-13）