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【摘要】 最近，细胞外囊泡已成为在细胞生物学和生物医学公认的重要成员。细胞外囊泡包括外泌体、微粒和凋亡小体，大多数分泌细胞中含有磷脂双分子层结构。重要的是，越来越多的证据支持细胞外囊泡可以作为在人类疾病中的生物标志物，治疗靶点或工具。心血管疾病无疑是其中最热门和快速增长的细胞外囊泡研究领域。然而，在有关不同的心血管疾病研究中，细胞外囊泡有时可以发挥不同的生物效应。因此，这些囊泡到底对心血管健康是有益或有害似乎还存在疑问。在这篇综述，笔者将介绍细胞外囊泡和概述其在心血管疾病的生物学作用。
【关键词】 细胞外囊泡； 外泌体； 微粒； 心血管疾病； microRNA
【Abstract】 Recently，extracellular vesicle plays a crucial role in both physiology and pathology.Extracellular vesicles，including exosomes，microparticles and apoptotic bodies，and most of the secretory cells contain phospholipid bilayer structure.Importantly，a growing body of evidence to support the extracellular vesicles can be used as a biomarker，therapeutic targets or tools in human disease.Cardiovascular disease is one of the most popular research areas and the rapid growth of extracellular vesicles.However，in the different cardiovascular disease study，extracellular vesicles can sometimes play a different biological effects.As a result，these vesicles what is beneficial or harmful to cardiovascular health，it seems，are still in doubt.In this review，we will introduce the extracellular vesicles and summarize its biological role in cardiovascular disease.
【Key words】 Extracellular vesicle； Exosomes； Microparticles； Cardiovascular diseases； microRNA
First-author’s address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.040
细胞之间的信息交换是通过实现释放特定的可溶性信号分子或细胞间直接联系。除了这些机制，最近认为通过细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）實现细胞间信息交换是一种被确认新的方法。EVs是由磷脂双分子层封闭组成不同大小的微粒（20～2000 nm），并在体内和体外几乎所有类型的细胞释放到细胞外介质中。到目前为止，根据不同的形成机制和生理特征分成三种不同的EVs形式：外泌体、细胞膜微粒、调亡小体。而外泌体可能是产生于核内体携带的多泡体，细胞膜微粒和调亡小体来源于细胞质膜释放的微囊泡（Microvesicles，MVs）[1]。EVs提供一个简单的方式在细胞之间交换生物分子，在一个囊泡中，可以发现脂质、蛋白质（受体和酶）、第二信使、信使RNA、microRNA、细胞器碎片等。
1 EVs生物起源的机制
1.1 钙离子依赖机制 这种机制包括微粒和凋亡小体形成。已经证明微粒从细胞质膜脱落进入细胞外空间是由细胞外钙离子的流入增加细胞质钙浓度导致。增加钙离子激活需钙蛋白酶导致各种细胞骨架相关蛋白质的降解，因此细胞膜出芽和EVs释放是由磷脂再分配之间的动态相互作用及细胞骨架重组的结果导致。此外，微粒释放通常是细胞质膜不稳定和出泡，可能是由细胞膜局部扰动造成失去不对称双分子层结构的局部扰动导致膜表面的磷脂酰丝氨酸暴露[2]。细胞凋亡过程中生成的调亡小体根据钙敏感因素区分各种细胞内细胞器，包括内质网和线粒体。
1.2 非钙离子依赖机制 外泌体来源于细胞内吞体膜间隔，它们是在胞外分泌多泡体后释放到细胞外空间，然后与细胞质膜融合。这种机制依赖于细胞骨架的激活，但独立于细胞质钙离子浓度。细胞外囊泡的生成涉及独立的机制，所有类型的EVs从选择性细胞生成过程导致显著不同的选择性富集特定蛋白质，信使RNA和microRNA。这不是细胞膜颗粒从非特定情况下的细胞退化。例如，单核细胞选择性包裹和分泌microRNA-150至外泌体中和释放它们至内皮受体细胞exmiRNA-150中来调节内皮细胞功能[3]。这些发现说明，EVs从非特定的细胞退化很容易区分膜微粒。
2 EVs的分离与表征鉴定
2.1 EVs的分离 尽管微泡和外泌体是由不同的机制生成，它们部分大小重叠，大多数分离方法并不能分离一个单纯的个体。因此重要的是要了解什么类型的EVs是最有可能通过何种方法被分离的。许多不同的方法已经优化提纯来自不同来源不同类型的EVs，血浆分离是最好的方法[4-5]。现在一般建议从血液分离EVs需要在抗凝血剂柠檬酸中快速收集[6]。分离EVs最简单的技术就是连续离心分离法。血浆收集后在1500 r/min条件下离心15 min，上清液含有富含血小板的血浆和EVs（微泡和外泌体）。接着下一步取上清液在13 000 r/min条件下离心30 min得到含有少量血浆血小板EVs的上清液。为进一步纯化贫血小板血浆可在17 000 r/min条件下离心得到大颗粒的微泡，这可以用以分析。上层清液还可以进一步在100 000 r/min条件下离心获得EVs。尽管生成的EVs有时也被称为外泌体，这种物质并非完全纯化和除了外泌体可能含有MVs甚至脂蛋白。密度梯度离心法可用于进一步纯化核外物质[7]，但最近的证据表明，这仍然没有完全消除脂蛋白等物质。分子筛层析法是越来越受欢迎的一个分离外泌体的技术，被证明导致分离相对纯化的含有少量的脂蛋白和蛋白质复合物等[8]。 2.2 EVs的表征鉴定 微小的EVs使识别它们成为一个难题，事实上直到最近它们仍被认为是一种碎片，没有任何重要性的功能。使用电子显微镜使不同类型的EVs准确分级，这是一个证实EVs存在的金标准，不过这种方法耗时，不定量和不适合表型分析[9]。其他非光学方法已经被使用，特别是原子力显微镜，能够检测精确的尺寸，也可以用于抗体标记囊泡后的表型。同样地，这种技术费时和需要一定的样品浓度且不能定量检测。大量的光学方法已被用于检测EVs，其中最广泛应用的是流式细胞术，然而检测仅限于直径大于200 nm的颗粒，所以分析外泌体不可能有标准参数和技术。然而，最近的令人兴奋的发展是使用图像流技术在全血、富含血小板和无血小板血浆中直接可视化和特性描述MVs[10]。
许多复杂的研究描述了使用从背景噪声中这种方法检测区分MVs，优化采集血浆检测MVs的标准化指南现在已经公布[11]。甚至可能允许专用检测个体外泌体的有特殊标记流式细胞计数器技术被开发出来[12]。流式细胞术（FCM）允许直接分析微泡（MVs）和间接分析（共轭）的外泌体。纳米粒子跟踪分析（NTA）是EVs定量的首选技术。电子显微镜（EM）是EVs可视化的黄金标准。
3 EVs在心血管疾病中的重要地位
3.1 EVs的生物学功能 虽然很难证明EVs的生理作用，但证据表明，由于其固有的成分，EVs具有特定的功能，此外他们可能参与调节循环细胞的不同功能。因此，EVs可以调节和参与凝聚、组织修复和干细胞维护。
例如，在凝血过程中，血小板提供一个加速血液凝固和促进纤维蛋白形成血栓的细胞膜表面是其主要功能之一[13]。因此，血小板源性细胞外囊泡膜的特定促凝血的活性大约高于激活血小板50～100倍，这是由于增强磷脂酰丝氨酸、CD61、CD62P和限制因子X的表面密度[14]。关于组织修复，EVs可以参与伤口愈合中血管网生成的生理过程。事实上，来源于内皮细胞的EVs，含有金属蛋白酶蛋白（MMP-2和MMP-9），促进基质降解，从而促进新血管的形成[15]。最后，EVs诱导干细胞高效细胞分化参与维护干细胞稳定和受损组织的修复。在这种背景下，文献[16]报道，EVs从基质干细胞胞双向调节交换遗传信息。EVs不仅可以获得受损组织细胞的特点来重组干细胞的表型，而且他们可能诱发存活的细胞去分化使损伤组织再生。
3.2 心脏EVs在心血管疾病发病中的作用 心脏EVs包括血管内皮细胞、心肌细胞及成纤维细胞等的EVs。许多研究已经证明在冠状动脉疾病患者中循环内皮细胞MVs的数量和内皮功能障碍之间的相关性[17]。同样，在2型糖尿病患者中更高数量的内皮细胞MVs与内皮功能受损相关[18]。除了与内皮功能障碍水平增加，MVs也可能直接影响内皮功能。另一方面，EVs也被观察到一些有利的影响，尤其是在体外可以刺激内皮细胞增殖、迁移，和管腔形成[19]。这种效应也可以从来源于凋亡内皮细胞的EVs中观察到，因此可能包含许多凋亡小泡[19]。从心肌祖细胞分离得到的EVs已被证明有类似的对内皮细胞增殖和迁移的影响[20]。
EVs还可以促进内皮修复。例如，内皮EVs在人冠状动脉内皮细胞发生凋亡时被离心分离得到。当给予小鼠裸露内皮组织部位注射EVs，发现这些EVs能够通过传递miR-126修复内皮[19]。然而重要的是，来源于体外高糖环境培养或2型糖尿病患者的細胞分离得到的EVs不具备这种效应，因此表明高血糖改变EVs的性能和可能导致持续的血管损伤和功能障碍[19]。同样，从非糖尿病大鼠的心肌细胞分离得到的外泌体被发现在体外可以促血管形成，促进血管内皮细胞增殖、迁移，和管腔形成，而从糖尿病大鼠的心肌细胞分离的得到了相反的效应[17]。
EVs也参与动脉粥样硬化，来自动脉粥样硬化斑块患者的EVs通过传递ICAM-1分子有利于单核细胞与内皮细胞的粘附增强炎症反应导致动脉粥样硬化斑块增加[21]。事实上，在高剪切应力刺激内皮细胞分泌含丰富miR-143/145的EVs。一旦转移到平滑肌细胞，这些囊泡减少miR-143/145目标蛋白的表达如ELK1和CAMK2d，平滑肌细胞表型的两个主要调节器，并促进平滑肌细胞去分化和抑制增殖，与动脉粥样硬化事件发展相关。这些数据提供了证据表明动脉粥样硬化促进因素如剪切应力，通过激活ρ激酶和ERK1/2通路[22]，诱导EVs释放携带动脉粥样硬化microRNA可能代表一个对动脉粥样硬化治疗策略[23]。有趣的是，EVs来自在动脉粥样硬化生成包含miR-126的调亡内皮细胞，在体内控制内皮细胞信号传导和提供抗动脉粥样硬化作用。事实上，在ApoE-/-的动脉粥样硬化模型，提出凋亡内皮细胞衍生EVs通过减少斑块面积和巨噬细胞浸润血管壁限制动脉粥样硬化进展，通过趋化因子CXCL12的生成促进祖细胞的动员，一个抗调亡存活因子，导致粥样硬化斑块稳[24]。糖尿病时很多因素如胰岛素抵抗、高胰岛素血症、炎症和细胞因子等都可以诱导p38MAPK的活化，p38MAPK通过影响单核-巨噬细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞等参与微血管病变[25]。在糖尿病患者调亡内皮细胞生成含miR-126减少的EVs，这可能解释了糖尿病患者周围血管生成信号的受损[26]。
3.3 EVs有望作为治疗心血管疾病的一种新手段 心脏是终末分化器官，意味着心肌细胞损伤后很少有自我修复可能。干细胞疗法心肌细胞可再生的可能性已经深入研究了数年。已经观察到一些干细胞疗法后可改善心脏功能，尽管这是公认出现在缺乏新的心肌细胞的形成。因此建议干细胞以旁分泌的方式释放细胞因子，生长因子，和其他蛋白质改善心肌细胞的生存力和功能[27]。
研究表明，利用高效液相色谱凝胶分离法从间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）培养液中分离纯化的外泌体，可以在体内和体外保护心脏[28]。外泌体干预后1 h至第2天可观察到心肌保护激酶Akt和GSK3α/β的活性增加，28 d后也改善了心脏功能[29]，这些激酶具有高度的心肌保护作用。在另一项研究中，从间充质干细胞分离纯化的外泌体过表达GATA4，当注射至心肌梗死大鼠时可修复心脏收缩功能和减少梗死面积[27]。由于增加miR-19a的表达对心脏有一定保护作，目标蛋白PTEN，间接增加蛋白激酶B和ERK的活性。然而，这些实验很难确定是否MSC来源外泌体传递miR-19a或是一种心肌治疗的转录调节反应[27]。激活保护通路的能力并不只局限于外泌体，因为源自成人间充质干细胞的MVs还可以防止肾脏缺血和再灌注损伤[30]。 MSC已被證明释放外泌体对心血管疾病有益的唯一类型的干细胞。从小鼠心肌内注射来源于心脏祖细胞的外泌体可减少心肌缺氧和再灌注后细胞凋亡[31]。在另一项研究中，来源于心脏瓣膜手术患者心房附件外植体的心脏祖细胞分离得到Evs[32]。这些CPCs-EVs注入到受到永久的冠状动脉结扎的老鼠体内，在第二天至第七天，减少心肌细胞凋亡和瘢痕面积，在梗死区域增加存活心肌的数量，增加血管密度，防止心室功能受损[32]。相比之下，从正常的人类皮肤成纤维细胞分离出的外泌体没有这种作用，表明效应取决于起源于何种细胞类型[32]。
HIF是DNA结合转录因子，通过转录激活多种基因编码的蛋白质，在缺氧的情况下减轻缺氧对细胞的损伤。从基因调控研究中可见，心肌缺血时HIF-1a表达增多主要对心肌起保护作用[33]。当一个病毒mini-circle质粒携带HIF1转染至小鼠缺血心肌内皮细胞中，转录因子产生的适应性缺氧反应，发现这些细胞释放有较高mirR-126和mirR-210含量的外泌体。这些外泌体通过心脏内皮祖细胞影响心脏功能，导致促生存激酶的活化和对糖酵解的开关。这导致它们对低氧应激的耐受性增加[34]和表明内皮细胞通过外泌体携microRNA可以支持心脏内皮祖细胞生存的可能性。
EVs是一种传递生物分子的工具，成为在心血管疾病和其他疾病中调节有害或有益的作用的新成员。为了更好地理解EVs的生物效应，对囊泡的内容转录组，microRNA和蛋白质组学的分析研究是必要的。这需要在未来的研究中更多地去研究EVs的组成、生化特性以及参与调控的具体机制，并与临床相关疾病紧密结合。另外，对不同组分和功能EVs的测定和评估可能成为评价心血管疾病风险和监测临床治疗效果的新方法。EVs是一种新型生物学标志物，作为干细胞移植疗法中的关键载体，为研究和完善心脏保护性治疗靶点提供了新思路，未来EVs在心血管疾病中可能作为一种潜在的治疗手段。
参考文献
[1] EL Andaloussi S，M?ger I，Breakefield X O，et al.Extracellular vesicles：biologyand emerging therapeutic opportunities[J].Nat Rev Drug Discov，2013，12（5）：347-357.
[2] Martinez M C，Tual-Chalot S，Leonetti D，et al.Microparticles：targetsand tools in cardiovascular disease[J].Trends Pharmacol Sci，2011，32（11）：659-665.
[3] Zhang Y，Liu D，Chen X，et al.Secreted monocytic miR-150 enhancestargeted endothelial cell migration[J].Mol Cell，2010，39（1）：133-144.
[4] Witwer K W，Buzas E I，Bemis L T，et al.Standardization of sample collection，isolation and analysis methods in extracellular vesicle research[J]. Journal of Extracellular Vesicles，2013，2：1-25.
[5] Lobb R J，Becker M，Wen S W，et al.Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma[J].Journal of Extracellular Vesicles，2014，3：1-11.
[6] Lacroix R，Judicone C，Poncelet P，et al.Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles：towards standardization of protocol[J].Journal of Thrombosis and Haemostasis，2012，10（3）：437-446.
[7] Théry C，Amigorena S，Raposo G，et al.Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc in Cell Biol，2006，Chapter 3：Unit 3.22.
[8] Welton J L，Webber J P，Botos L A，et al.Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma[J].Journal of Extracellular Vesicles，2014，4：27 269.
[9] van der Pol E，Hoekstra A G，Sturk A，et al.Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes[J].Journal of Thrombosis and Haemostasis，2010，8（12）：2596-2607. [10] Headland S E，Jones H R，D’Sa A S，et al.Cuttingedge analysis of extracellular microparticles using ImageStream（X） imaging flow cytometry[J].Scientific Reports，2014，4（14）：81.
[11] Lacroix R，Dignat-George F.Microparticles as a circulating source of procoagulant and fibrinolytic activities in the circulation[J].Thrombosis Research，2012，129 Suppl 2（5）：S27-S29.
[12] Pospichalova V，Svoboda J，Dave Z，et al.Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer[J].Journal of Extracellular Vesicles，2015，4：25 530.
[13] Tans G，Rosing J，Thomassen M C，et al.Comparison of antico-agulant and procoagulant activities of stimulated platelets and platelet-derivedmicroparticles[J].Blood，1991，77（12）：2641-2648.
[14] Sinauridze E I，Kireev D A，Popenko N Y，et al.Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher spe-cific procoagulant activity than activated platelets[J].Thromb & Haemost，2007，97（3）：425-434.
[15] Taraboletti G，D’Ascenzo S，Borsotti P，et al.Shedding of the matrix metalloproteinases MMP-2，MMP-9，and MT1-MMP as membrane vesicle-associated components by endothelial cells[J].Am J Pathol，2002，160（2）：673-680.
[16] Camussi G，Deregibus M C，Cantaluppi V.Role of stem-cell-derived microvesicles in the paracrine action of stem cells[J].Biochem Soc Trans，2013，41（1）：283-287.
[17] Wang X，Huang W，Liu G，et al.Cardiomyocytes mediate anti-angiogenesis in type 2 diabetic rats through the exosomal transfer of miR-320 into endothelial cells[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2014，74（9）：139-150.
[18] Feng B，Chen Y，Luo Y，et al.Circulating level of microparticles and their correlation with arterial elasticity and endothelium-dependent dilation in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Atherosclerosis，2009，208（1）：264-269.
[19] Jansen F，Yang X，Hoelscher M，et al.Endothelial microparticle-mediated transfer of MicroRNA-126 promotes vascular endothelial cell repair via SPRED1 and is abrogated in glucose-damaged endothelial microparticles[J].Circulation，2013，128（18）：2026-2038.
[20] Vrijsen K R，Sluijter J P，Schuchardt M W，et al.Cardiomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate migration of endothelial cells.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2010，14（5）：1064-1070.
[21] Rautou P E，Leroyer A S，Ramkhelawon B，et al.Microparticles from human atherosclerotic plaques promote endothelial ICAM-1-dependent monocyte adhesion and transendothelial migration[J].Circ Res，2011，108（3）：335-343. [22] Vion A C，Ramkhelawon B，Loyer X，et al.Shear stress regulates endothelial microparticle release[J].Circ Res，2013，112（10）：1323-1333.
[23] Hergenreider E，Heydt S，Treguer K，et al.Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs[J].Nature Cell Biology，2012，14（3）：249-256.
[24] Zernecke A，Bidzhekov K，Noels H，et al.Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection[J].Sci Signal，2009，2（100）：ra81.
[25]揭海，吴铿.p38MAPK在糖尿病心肌病中的作用研究进展[J].中国医学创新，2015，12（13）：153-156.
[26] Zampetaki A，Mayr M.MicroRNAs in vascular and metabolic disease[J].Circ Res，2012，110（3）：508-522.
[27] Yu B，Kim H W，Gong M，et al.Exosomes secreted from GATA-4 overexpressing mesenchymal stem cells serve as a reservoir of anti-apoptotic microRNAs for Cardioprotection[J].International Journal of Cardiology，2015，182C：349-360.
[28] Lai R C，Arslan F，Lee M M，et al.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Stem Cell Research，2010，4（3）：214-222.
[29] Arslan F，Lai R C，Smeets M B，et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels，decrease oxidativestress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Stem Cell Research，2013，10（3）：301-312.
[30] Gatti S，Bruno S，Deregibus M C，et al.Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury[J].Nephrology Dialysis Transplantation，2011，26（5）：1474-1483.
[31] Chen L，Wang Y，Pan Y，et al.Cardiac progenitor-derived Exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，431（3）：566-571.
[32] Barile L，Lionetti V，Cervio E，et al.Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction[J].Cardiovascular Research，2014，103（4）：530-541.
[33]李興岳，郭润民，梁伟钧.缺血缺氧导致心肌自噬的分子机制[J].中国医学创新，2015，12（36）：153-156.
[34] Ong S G，Lee W H，Huang M，et al.Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease：role of exosomal microRNA transfer[J].Circulation，2014，130（1）：S60-S69.
（收稿日期：2016-08-04） （本文编辑：程旭然）
【关键词】 细胞外囊泡； 外泌体； 微粒； 心血管疾病； microRNA
【Abstract】 Recently，extracellular vesicle plays a crucial role in both physiology and pathology.Extracellular vesicles，including exosomes，microparticles and apoptotic bodies，and most of the secretory cells contain phospholipid bilayer structure.Importantly，a growing body of evidence to support the extracellular vesicles can be used as a biomarker，therapeutic targets or tools in human disease.Cardiovascular disease is one of the most popular research areas and the rapid growth of extracellular vesicles.However，in the different cardiovascular disease study，extracellular vesicles can sometimes play a different biological effects.As a result，these vesicles what is beneficial or harmful to cardiovascular health，it seems，are still in doubt.In this review，we will introduce the extracellular vesicles and summarize its biological role in cardiovascular disease.
【Key words】 Extracellular vesicle； Exosomes； Microparticles； Cardiovascular diseases； microRNA
First-author’s address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.040
细胞之间的信息交换是通过实现释放特定的可溶性信号分子或细胞间直接联系。除了这些机制，最近认为通过细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）實现细胞间信息交换是一种被确认新的方法。EVs是由磷脂双分子层封闭组成不同大小的微粒（20～2000 nm），并在体内和体外几乎所有类型的细胞释放到细胞外介质中。到目前为止，根据不同的形成机制和生理特征分成三种不同的EVs形式：外泌体、细胞膜微粒、调亡小体。而外泌体可能是产生于核内体携带的多泡体，细胞膜微粒和调亡小体来源于细胞质膜释放的微囊泡（Microvesicles，MVs）[1]。EVs提供一个简单的方式在细胞之间交换生物分子，在一个囊泡中，可以发现脂质、蛋白质（受体和酶）、第二信使、信使RNA、microRNA、细胞器碎片等。
1 EVs生物起源的机制
1.1 钙离子依赖机制 这种机制包括微粒和凋亡小体形成。已经证明微粒从细胞质膜脱落进入细胞外空间是由细胞外钙离子的流入增加细胞质钙浓度导致。增加钙离子激活需钙蛋白酶导致各种细胞骨架相关蛋白质的降解，因此细胞膜出芽和EVs释放是由磷脂再分配之间的动态相互作用及细胞骨架重组的结果导致。此外，微粒释放通常是细胞质膜不稳定和出泡，可能是由细胞膜局部扰动造成失去不对称双分子层结构的局部扰动导致膜表面的磷脂酰丝氨酸暴露[2]。细胞凋亡过程中生成的调亡小体根据钙敏感因素区分各种细胞内细胞器，包括内质网和线粒体。
1.2 非钙离子依赖机制 外泌体来源于细胞内吞体膜间隔，它们是在胞外分泌多泡体后释放到细胞外空间，然后与细胞质膜融合。这种机制依赖于细胞骨架的激活，但独立于细胞质钙离子浓度。细胞外囊泡的生成涉及独立的机制，所有类型的EVs从选择性细胞生成过程导致显著不同的选择性富集特定蛋白质，信使RNA和microRNA。这不是细胞膜颗粒从非特定情况下的细胞退化。例如，单核细胞选择性包裹和分泌microRNA-150至外泌体中和释放它们至内皮受体细胞exmiRNA-150中来调节内皮细胞功能[3]。这些发现说明，EVs从非特定的细胞退化很容易区分膜微粒。
2 EVs的分离与表征鉴定
2.1 EVs的分离 尽管微泡和外泌体是由不同的机制生成，它们部分大小重叠，大多数分离方法并不能分离一个单纯的个体。因此重要的是要了解什么类型的EVs是最有可能通过何种方法被分离的。许多不同的方法已经优化提纯来自不同来源不同类型的EVs，血浆分离是最好的方法[4-5]。现在一般建议从血液分离EVs需要在抗凝血剂柠檬酸中快速收集[6]。分离EVs最简单的技术就是连续离心分离法。血浆收集后在1500 r/min条件下离心15 min，上清液含有富含血小板的血浆和EVs（微泡和外泌体）。接着下一步取上清液在13 000 r/min条件下离心30 min得到含有少量血浆血小板EVs的上清液。为进一步纯化贫血小板血浆可在17 000 r/min条件下离心得到大颗粒的微泡，这可以用以分析。上层清液还可以进一步在100 000 r/min条件下离心获得EVs。尽管生成的EVs有时也被称为外泌体，这种物质并非完全纯化和除了外泌体可能含有MVs甚至脂蛋白。密度梯度离心法可用于进一步纯化核外物质[7]，但最近的证据表明，这仍然没有完全消除脂蛋白等物质。分子筛层析法是越来越受欢迎的一个分离外泌体的技术，被证明导致分离相对纯化的含有少量的脂蛋白和蛋白质复合物等[8]。 2.2 EVs的表征鉴定 微小的EVs使识别它们成为一个难题，事实上直到最近它们仍被认为是一种碎片，没有任何重要性的功能。使用电子显微镜使不同类型的EVs准确分级，这是一个证实EVs存在的金标准，不过这种方法耗时，不定量和不适合表型分析[9]。其他非光学方法已经被使用，特别是原子力显微镜，能够检测精确的尺寸，也可以用于抗体标记囊泡后的表型。同样地，这种技术费时和需要一定的样品浓度且不能定量检测。大量的光学方法已被用于检测EVs，其中最广泛应用的是流式细胞术，然而检测仅限于直径大于200 nm的颗粒，所以分析外泌体不可能有标准参数和技术。然而，最近的令人兴奋的发展是使用图像流技术在全血、富含血小板和无血小板血浆中直接可视化和特性描述MVs[10]。
许多复杂的研究描述了使用从背景噪声中这种方法检测区分MVs，优化采集血浆检测MVs的标准化指南现在已经公布[11]。甚至可能允许专用检测个体外泌体的有特殊标记流式细胞计数器技术被开发出来[12]。流式细胞术（FCM）允许直接分析微泡（MVs）和间接分析（共轭）的外泌体。纳米粒子跟踪分析（NTA）是EVs定量的首选技术。电子显微镜（EM）是EVs可视化的黄金标准。
3 EVs在心血管疾病中的重要地位
3.1 EVs的生物学功能 虽然很难证明EVs的生理作用，但证据表明，由于其固有的成分，EVs具有特定的功能，此外他们可能参与调节循环细胞的不同功能。因此，EVs可以调节和参与凝聚、组织修复和干细胞维护。
例如，在凝血过程中，血小板提供一个加速血液凝固和促进纤维蛋白形成血栓的细胞膜表面是其主要功能之一[13]。因此，血小板源性细胞外囊泡膜的特定促凝血的活性大约高于激活血小板50～100倍，这是由于增强磷脂酰丝氨酸、CD61、CD62P和限制因子X的表面密度[14]。关于组织修复，EVs可以参与伤口愈合中血管网生成的生理过程。事实上，来源于内皮细胞的EVs，含有金属蛋白酶蛋白（MMP-2和MMP-9），促进基质降解，从而促进新血管的形成[15]。最后，EVs诱导干细胞高效细胞分化参与维护干细胞稳定和受损组织的修复。在这种背景下，文献[16]报道，EVs从基质干细胞胞双向调节交换遗传信息。EVs不仅可以获得受损组织细胞的特点来重组干细胞的表型，而且他们可能诱发存活的细胞去分化使损伤组织再生。
3.2 心脏EVs在心血管疾病发病中的作用 心脏EVs包括血管内皮细胞、心肌细胞及成纤维细胞等的EVs。许多研究已经证明在冠状动脉疾病患者中循环内皮细胞MVs的数量和内皮功能障碍之间的相关性[17]。同样，在2型糖尿病患者中更高数量的内皮细胞MVs与内皮功能受损相关[18]。除了与内皮功能障碍水平增加，MVs也可能直接影响内皮功能。另一方面，EVs也被观察到一些有利的影响，尤其是在体外可以刺激内皮细胞增殖、迁移，和管腔形成[19]。这种效应也可以从来源于凋亡内皮细胞的EVs中观察到，因此可能包含许多凋亡小泡[19]。从心肌祖细胞分离得到的EVs已被证明有类似的对内皮细胞增殖和迁移的影响[20]。
EVs还可以促进内皮修复。例如，内皮EVs在人冠状动脉内皮细胞发生凋亡时被离心分离得到。当给予小鼠裸露内皮组织部位注射EVs，发现这些EVs能够通过传递miR-126修复内皮[19]。然而重要的是，来源于体外高糖环境培养或2型糖尿病患者的細胞分离得到的EVs不具备这种效应，因此表明高血糖改变EVs的性能和可能导致持续的血管损伤和功能障碍[19]。同样，从非糖尿病大鼠的心肌细胞分离得到的外泌体被发现在体外可以促血管形成，促进血管内皮细胞增殖、迁移，和管腔形成，而从糖尿病大鼠的心肌细胞分离的得到了相反的效应[17]。
EVs也参与动脉粥样硬化，来自动脉粥样硬化斑块患者的EVs通过传递ICAM-1分子有利于单核细胞与内皮细胞的粘附增强炎症反应导致动脉粥样硬化斑块增加[21]。事实上，在高剪切应力刺激内皮细胞分泌含丰富miR-143/145的EVs。一旦转移到平滑肌细胞，这些囊泡减少miR-143/145目标蛋白的表达如ELK1和CAMK2d，平滑肌细胞表型的两个主要调节器，并促进平滑肌细胞去分化和抑制增殖，与动脉粥样硬化事件发展相关。这些数据提供了证据表明动脉粥样硬化促进因素如剪切应力，通过激活ρ激酶和ERK1/2通路[22]，诱导EVs释放携带动脉粥样硬化microRNA可能代表一个对动脉粥样硬化治疗策略[23]。有趣的是，EVs来自在动脉粥样硬化生成包含miR-126的调亡内皮细胞，在体内控制内皮细胞信号传导和提供抗动脉粥样硬化作用。事实上，在ApoE-/-的动脉粥样硬化模型，提出凋亡内皮细胞衍生EVs通过减少斑块面积和巨噬细胞浸润血管壁限制动脉粥样硬化进展，通过趋化因子CXCL12的生成促进祖细胞的动员，一个抗调亡存活因子，导致粥样硬化斑块稳[24]。糖尿病时很多因素如胰岛素抵抗、高胰岛素血症、炎症和细胞因子等都可以诱导p38MAPK的活化，p38MAPK通过影响单核-巨噬细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞等参与微血管病变[25]。在糖尿病患者调亡内皮细胞生成含miR-126减少的EVs，这可能解释了糖尿病患者周围血管生成信号的受损[26]。
3.3 EVs有望作为治疗心血管疾病的一种新手段 心脏是终末分化器官，意味着心肌细胞损伤后很少有自我修复可能。干细胞疗法心肌细胞可再生的可能性已经深入研究了数年。已经观察到一些干细胞疗法后可改善心脏功能，尽管这是公认出现在缺乏新的心肌细胞的形成。因此建议干细胞以旁分泌的方式释放细胞因子，生长因子，和其他蛋白质改善心肌细胞的生存力和功能[27]。
研究表明，利用高效液相色谱凝胶分离法从间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）培养液中分离纯化的外泌体，可以在体内和体外保护心脏[28]。外泌体干预后1 h至第2天可观察到心肌保护激酶Akt和GSK3α/β的活性增加，28 d后也改善了心脏功能[29]，这些激酶具有高度的心肌保护作用。在另一项研究中，从间充质干细胞分离纯化的外泌体过表达GATA4，当注射至心肌梗死大鼠时可修复心脏收缩功能和减少梗死面积[27]。由于增加miR-19a的表达对心脏有一定保护作，目标蛋白PTEN，间接增加蛋白激酶B和ERK的活性。然而，这些实验很难确定是否MSC来源外泌体传递miR-19a或是一种心肌治疗的转录调节反应[27]。激活保护通路的能力并不只局限于外泌体，因为源自成人间充质干细胞的MVs还可以防止肾脏缺血和再灌注损伤[30]。 MSC已被證明释放外泌体对心血管疾病有益的唯一类型的干细胞。从小鼠心肌内注射来源于心脏祖细胞的外泌体可减少心肌缺氧和再灌注后细胞凋亡[31]。在另一项研究中，来源于心脏瓣膜手术患者心房附件外植体的心脏祖细胞分离得到Evs[32]。这些CPCs-EVs注入到受到永久的冠状动脉结扎的老鼠体内，在第二天至第七天，减少心肌细胞凋亡和瘢痕面积，在梗死区域增加存活心肌的数量，增加血管密度，防止心室功能受损[32]。相比之下，从正常的人类皮肤成纤维细胞分离出的外泌体没有这种作用，表明效应取决于起源于何种细胞类型[32]。
HIF是DNA结合转录因子，通过转录激活多种基因编码的蛋白质，在缺氧的情况下减轻缺氧对细胞的损伤。从基因调控研究中可见，心肌缺血时HIF-1a表达增多主要对心肌起保护作用[33]。当一个病毒mini-circle质粒携带HIF1转染至小鼠缺血心肌内皮细胞中，转录因子产生的适应性缺氧反应，发现这些细胞释放有较高mirR-126和mirR-210含量的外泌体。这些外泌体通过心脏内皮祖细胞影响心脏功能，导致促生存激酶的活化和对糖酵解的开关。这导致它们对低氧应激的耐受性增加[34]和表明内皮细胞通过外泌体携microRNA可以支持心脏内皮祖细胞生存的可能性。
EVs是一种传递生物分子的工具，成为在心血管疾病和其他疾病中调节有害或有益的作用的新成员。为了更好地理解EVs的生物效应，对囊泡的内容转录组，microRNA和蛋白质组学的分析研究是必要的。这需要在未来的研究中更多地去研究EVs的组成、生化特性以及参与调控的具体机制，并与临床相关疾病紧密结合。另外，对不同组分和功能EVs的测定和评估可能成为评价心血管疾病风险和监测临床治疗效果的新方法。EVs是一种新型生物学标志物，作为干细胞移植疗法中的关键载体，为研究和完善心脏保护性治疗靶点提供了新思路，未来EVs在心血管疾病中可能作为一种潜在的治疗手段。
参考文献
[1] EL Andaloussi S，M?ger I，Breakefield X O，et al.Extracellular vesicles：biologyand emerging therapeutic opportunities[J].Nat Rev Drug Discov，2013，12（5）：347-357.
[2] Martinez M C，Tual-Chalot S，Leonetti D，et al.Microparticles：targetsand tools in cardiovascular disease[J].Trends Pharmacol Sci，2011，32（11）：659-665.
[3] Zhang Y，Liu D，Chen X，et al.Secreted monocytic miR-150 enhancestargeted endothelial cell migration[J].Mol Cell，2010，39（1）：133-144.
[4] Witwer K W，Buzas E I，Bemis L T，et al.Standardization of sample collection，isolation and analysis methods in extracellular vesicle research[J]. Journal of Extracellular Vesicles，2013，2：1-25.
[5] Lobb R J，Becker M，Wen S W，et al.Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma[J].Journal of Extracellular Vesicles，2014，3：1-11.
[6] Lacroix R，Judicone C，Poncelet P，et al.Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles：towards standardization of protocol[J].Journal of Thrombosis and Haemostasis，2012，10（3）：437-446.
[7] Théry C，Amigorena S，Raposo G，et al.Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc in Cell Biol，2006，Chapter 3：Unit 3.22.
[8] Welton J L，Webber J P，Botos L A，et al.Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma[J].Journal of Extracellular Vesicles，2014，4：27 269.
[9] van der Pol E，Hoekstra A G，Sturk A，et al.Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes[J].Journal of Thrombosis and Haemostasis，2010，8（12）：2596-2607. [10] Headland S E，Jones H R，D’Sa A S，et al.Cuttingedge analysis of extracellular microparticles using ImageStream（X） imaging flow cytometry[J].Scientific Reports，2014，4（14）：81.
[11] Lacroix R，Dignat-George F.Microparticles as a circulating source of procoagulant and fibrinolytic activities in the circulation[J].Thrombosis Research，2012，129 Suppl 2（5）：S27-S29.
[12] Pospichalova V，Svoboda J，Dave Z，et al.Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer[J].Journal of Extracellular Vesicles，2015，4：25 530.
[13] Tans G，Rosing J，Thomassen M C，et al.Comparison of antico-agulant and procoagulant activities of stimulated platelets and platelet-derivedmicroparticles[J].Blood，1991，77（12）：2641-2648.
[14] Sinauridze E I，Kireev D A，Popenko N Y，et al.Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher spe-cific procoagulant activity than activated platelets[J].Thromb & Haemost，2007，97（3）：425-434.
[15] Taraboletti G，D’Ascenzo S，Borsotti P，et al.Shedding of the matrix metalloproteinases MMP-2，MMP-9，and MT1-MMP as membrane vesicle-associated components by endothelial cells[J].Am J Pathol，2002，160（2）：673-680.
[16] Camussi G，Deregibus M C，Cantaluppi V.Role of stem-cell-derived microvesicles in the paracrine action of stem cells[J].Biochem Soc Trans，2013，41（1）：283-287.
[17] Wang X，Huang W，Liu G，et al.Cardiomyocytes mediate anti-angiogenesis in type 2 diabetic rats through the exosomal transfer of miR-320 into endothelial cells[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2014，74（9）：139-150.
[18] Feng B，Chen Y，Luo Y，et al.Circulating level of microparticles and their correlation with arterial elasticity and endothelium-dependent dilation in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Atherosclerosis，2009，208（1）：264-269.
[19] Jansen F，Yang X，Hoelscher M，et al.Endothelial microparticle-mediated transfer of MicroRNA-126 promotes vascular endothelial cell repair via SPRED1 and is abrogated in glucose-damaged endothelial microparticles[J].Circulation，2013，128（18）：2026-2038.
[20] Vrijsen K R，Sluijter J P，Schuchardt M W，et al.Cardiomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate migration of endothelial cells.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2010，14（5）：1064-1070.
[21] Rautou P E，Leroyer A S，Ramkhelawon B，et al.Microparticles from human atherosclerotic plaques promote endothelial ICAM-1-dependent monocyte adhesion and transendothelial migration[J].Circ Res，2011，108（3）：335-343. [22] Vion A C，Ramkhelawon B，Loyer X，et al.Shear stress regulates endothelial microparticle release[J].Circ Res，2013，112（10）：1323-1333.
[23] Hergenreider E，Heydt S，Treguer K，et al.Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs[J].Nature Cell Biology，2012，14（3）：249-256.
[24] Zernecke A，Bidzhekov K，Noels H，et al.Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection[J].Sci Signal，2009，2（100）：ra81.
[25]揭海，吴铿.p38MAPK在糖尿病心肌病中的作用研究进展[J].中国医学创新，2015，12（13）：153-156.
[26] Zampetaki A，Mayr M.MicroRNAs in vascular and metabolic disease[J].Circ Res，2012，110（3）：508-522.
[27] Yu B，Kim H W，Gong M，et al.Exosomes secreted from GATA-4 overexpressing mesenchymal stem cells serve as a reservoir of anti-apoptotic microRNAs for Cardioprotection[J].International Journal of Cardiology，2015，182C：349-360.
[28] Lai R C，Arslan F，Lee M M，et al.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Stem Cell Research，2010，4（3）：214-222.
[29] Arslan F，Lai R C，Smeets M B，et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels，decrease oxidativestress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Stem Cell Research，2013，10（3）：301-312.
[30] Gatti S，Bruno S，Deregibus M C，et al.Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury[J].Nephrology Dialysis Transplantation，2011，26（5）：1474-1483.
[31] Chen L，Wang Y，Pan Y，et al.Cardiac progenitor-derived Exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，431（3）：566-571.
[32] Barile L，Lionetti V，Cervio E，et al.Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction[J].Cardiovascular Research，2014，103（4）：530-541.
[33]李興岳，郭润民，梁伟钧.缺血缺氧导致心肌自噬的分子机制[J].中国医学创新，2015，12（36）：153-156.
[34] Ong S G，Lee W H，Huang M，et al.Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease：role of exosomal microRNA transfer[J].Circulation，2014，130（1）：S60-S69.
（收稿日期：2016-08-04） （本文编辑：程旭然）