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[摘要] 目的 建立门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光检测方法，用于门冬胰岛素的质量控制。 方法 参照《中国药典》三部附录及相关资料方法，对门冬胰岛素外源性DNA残留的荧光检测法进行研究，确定检测方法的最适条件，并对方法的线性、加样回收率、精密度、耐用性、重复性等方面进行方法学验证。 结果 建立了门冬胰岛素原料药中外源性DNA残留量的荧光检测方法，并进行了方法学验证。 结论 该方法操作简便、准确快捷，且无需标准宿主DNA，可用于门冬胰岛素质量标准中外源性DNA残留量的检测方法。
[关键词] 荧光法；外源性DNA残留；门冬胰岛素；质量控制
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）05-36-02
Detection of residual exogenous DNA in recombinant insulin aspart by fluorescence method
LV Ping1 WANG Hongming2 XIN Zhongshuai1 LI Jing1 LIANG Chenggang1
1.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050, China;2.Institute for Drug Conrtol of Binzhou City,Binzhou 256618,China
[Abstract] Objective To develop a fluorescence method of determining residual DNA in recombinant Insulin Aspart for its quality control. Methods According to CP (2010 edition) and relative methods, fluorescence method was researched .The method validation was studied from standard curve,recovery,precision,reproducibility etc. Results Fluorescence method of determining residual DNA was developed and the method was valided. Conclusion This method is convenient,fast and good reproducibility, it can be used determination of residual DNA in recombinant insulin aspart .
[Key words] Fluorescence method;Residual exogenous DNA;Insulin aspart;Quality control
门冬胰岛素是一种新型的人胰岛素改构产物，通过基因工程重组技术、利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物。该药物可在体内迅速起效产生降血糖的作用，有效地控制糖尿病患者的餐后血糖[1]。根据重组生物技术产品安全性评价的要求，产品中外源性DNA残留量的检测是一个重要项目，必须纳入质量标准中进行控制。2010年版《中国药典》三部附录收载了2种外源性DNA残留检测方法：DNA杂交法和荧光法。DNA杂交法是利用宿主DNA标记探针，与样品中外源性DNA特异性进行杂交，定性检查宿主DNA残留；荧光法是利用高灵敏度荧光染料与双链DNA结合形成复合物，在激发后可产生强荧光信号，在一定范围内荧光信号与DNA浓度成正比，因而可定量检查DNA的残留量。DNA杂交法操作周期较长，干扰因素多，重复性较差，不能进行定量分析，此外还需药品生产企业提供宿主菌DNA作为模板，因而有很大的局限性[2]。荧光法操作简单、快捷，且不需要宿主DNA作为模板，因而可广泛用于重组蛋白药物残余外源性DNA的检测。本研究运用荧光检测法对门冬胰岛素原料药中外源性DNA残留量进行检测，并进行了方法学验证，报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Spectra Max Gemini XS荧光酶标仪（Molecular Devices公
司）；饱和酚溶液（北京欣经科生物技术有限公司）；Quant-iTTM PicoGreendsDNA Assay Kit试剂盒（Invitrogen Molecular Probes公司）。
1.2 供试品
三批门冬胰岛素原料，为本室留样检品。
1.3 方法
1.3.1 供试品的处理方法
1.3.1.1 样品稀释法处理 以1.5 mg门冬胰岛素为1剂量计，用TE缓冲液分别配制浓度为4.0、2.0、1.0、0.5、0.1剂量/mL的样品溶液和加样回收溶液。
1.3.1.2 蛋白酶K消化法处理 分别取2.0、1.0、0.5剂量/mL的样品，加入终浓度为0.1 mg/mL的蛋白酶K溶液，混匀后37℃处理4 h，作为供试品进行测定，同时制备加样回收溶液。
1.3.1.3 酚氯仿法处理 取待处理的DNA标准品溶液、供试品溶液及供试品PPC，加入等体积的饱和酚溶液，充分振摇，10 000 rpm离心10 min；取上层水相，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（24∶1），充分振摇，同上离心，取上层水相；于通风橱中将残留氯仿挥发干净。
1.3.2 测定方法 取稀释法、蛋白酶K消化法及酚氯仿法处理的DNA标准溶液、供试品溶液及供试品加样回收溶液各400 μL于1.5 mL离心管中，加等体积荧光染料混匀，室温避光放置5 min。取250 μL于黑色酶标板中，每个样品平行三复孔。将加好样品的酶标板置于荧光酶标仪上，在激发波长480 nm、发射波长520 nm下测定荧光强度。数据用SoftMax PRO软件分析，作图并求得回归方程。
1.3.3 DNA标准曲线的建立 分别取500 μL，加BSA溶液100 μL，使DNA标准品终浓度为0、5、10、20、30、40、60、80 ng/mL。非酚氯仿法处理：取标准DNA溶液，用TE缓冲液分别稀释至0、5、10、20、30、40、60、80 ng/mL。酚氯仿法处理：取标准DNA溶液，用TE缓冲液分别稀释至0、6、12、24、36、48、72、96 ng/mL。
1.3.4 方法学验证
1.3.4.1 精密度 以供试品浓度为2剂量/mL，按20 ng/mL浓度加入标准DNA制备加样回收样品，平行制备7份加样回收样品分别进行测定。
1.3.4.2 准确性 （1）不同加样浓度的加样回收率：对2剂量/mL的供试品浓度分别进行了15、20、25 ng/mL浓度的加样回收率及样品DNA残留测定。（2）不同供试品浓度的加样回收率：分别研究了1剂量/mL和2剂量/mL两个供试品浓度的外源性DNA测定，以20 ng/mL 加样浓度制备加样回收样品，测定两个供试品浓度下的加样回收率。
1.3.5 三批供试品测定 将供试品制成2剂量/mL浓度，同时按20 ng/mL浓度制备每批供试品的加样回收样品，对三批供试品及加样回收样品进行测定。
2 结果
2.1 供试品处理方法
样品稀释法和蛋白酶K消化法的试验结果发现样品可能存在干扰，两种处理方法下的精密度和加样回收率都不能满足实验测定要求，表明该方法不适合本品的外源性DNA测定。采用酚氯仿法处理样品，供试品和加样回收样品都没有出现干扰，精密度、加样回收率等均能很好地满足实验测定要求，表明酚氯仿法处理样品适合于本品的DNA残留测定。
2.2 标准曲线
以荧光读数的平均值（n=3）对DNA含量作标准曲线回归方程，不用酚氯仿法处理和用酚氯仿法处理的标准曲线分别为：y=48.137+5.611x和y=50.996+4.338x，在0～80 ng/mL浓度范围内均呈线性相关，相关系数γ2均为0.999。考虑到酚氯仿处理后样品中的DNA有少量损失，标准DNA的制备应与供试品一致，以消除样品处理损失带来的误差。因此后续的研究中标准曲线都采用酚氯仿法处理的标准DNA。
2.3 精密度
7份平行样品的加样回收结果分别为82%、87%、85%、86%、81%、85%、85%，7次平行处理的样品加样回收率平均值为84%，其RSD为2.5%，表明该法的方法精密度良好。此外各个样品的平行三复孔的加样回收率的RSD平均值为2.3%，表明该法测定的仪器精密度良好，能满足实验测定要求。
2.4 回收率测定
2.4.1 不同加样浓度的加样回收率测定结果 加样浓度15 ng/mL的加样回收率为105%、20 ng/mL为105%、25 ng/mL为97%。在各个浓度下的加样回收率均在80%～120%之间，表明该法能准确测定供试品中DNA的残留量。
2.4.2 不同供试品浓度的加样回收率测定结果 供试品浓度1剂量/mL和2剂量/mL的加样回收率分别为97%和105%，结果表明在两个浓度下的供试品都具有良好的加样回收率，均符合系统适用性要求。
2.5 三批供试品测定结果
对三批供试品分别进行了3次重复试验，测定结果见表1。结果表明3次重复实验测定的三批供试品测定结果一致，重现性较好。加样回收率均在80%～120%之间，表明测定结果准确。供试品测定结果均低于5 ng/mL，即供试品中的残留DNA含量均低于2.5 ng/mL剂量。
3 讨论
在2010版中国药典实施之前，外源性DNA残留的检测都是采用地高辛标记探针的杂交法来完成的，由于杂交法自身的局限性，需研究要更为准确可靠的方法。荧光染料法在很大程度上可以弥补杂交法的局限性，很适合重组产品的残留DNA测定。荧光法的基本原理是依据荧光染料PicoGreen能够与双链DNA结合形成复合物，在波长480 nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520 nm处进行检测，在一定的DNA 浓度范围内以及该荧光染料过量的情况下，荧光信号与DNA浓度成正比[3-4]。荧光法可以不区分宿主菌来源，能够检测出重组制品中全部DNA 污染。
本研究参考《中国药典》DNA残留测定中的荧光染色法及相关资料方法，建立了门冬胰岛素中残留DNA的测定方法。研究中发现对样品的处理方法很关键，当样品中存在高浓度的蛋白时，有可能会干扰荧光染料和DNA的结合而影响实验结果的准确性。笔者在对门冬胰岛素的研究中发现单纯的样品稀释以及蛋白酶K法消化都不能很好的消除样品中的干扰，而利用酚氯仿抽提法则可以很好去除样品干扰，同时具有良好的加样回收率，表明测定结果准确可靠。笔者对建立的方法进行了方法学研究，结果表明该方法在DNA 含量0～80 ng/mL范围内线性良好，并有很好的精密度和加样回收率，测定结果准确可靠。此外对三批门冬胰岛素原料分别进行了3次外源性DNA残留量测定，加样回收率和测定结果均很一致，表明该法可用于门冬胰岛素原料外源性DNA残留量的质量控制。本研究结果也可以指导其他重组胰岛素及其类似物外源性DNA残留量的检测方法的建立。
[参考文献]
[1] 杨妤欣，陈隽.门冬胰岛素类似物研究概况[J].第三军医大学学报，2005，27（3）：270-272.
[2] 王军志.生物技术药物研究开发和质量控制[M].第2版.北京：科学出版社，2007：98.
[3] 饶春明，赵阳，李永红，等.应用荧光法测定重组细胞因子中残余DNA含量[J].药物分析杂志，2005，25（12）：1417-1419.
[4] 王兰，高凯，毕华，等.荧光法和DNA杂交法检测重组技术产品中残余DNA的比较[J].药物分析杂志，2009，29（7）：1063-1066.
（收稿日期：2012-01-06）
[关键词] 荧光法；外源性DNA残留；门冬胰岛素；质量控制
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）05-36-02
Detection of residual exogenous DNA in recombinant insulin aspart by fluorescence method
LV Ping1 WANG Hongming2 XIN Zhongshuai1 LI Jing1 LIANG Chenggang1
1.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050, China;2.Institute for Drug Conrtol of Binzhou City,Binzhou 256618,China
[Abstract] Objective To develop a fluorescence method of determining residual DNA in recombinant Insulin Aspart for its quality control. Methods According to CP (2010 edition) and relative methods, fluorescence method was researched .The method validation was studied from standard curve,recovery,precision,reproducibility etc. Results Fluorescence method of determining residual DNA was developed and the method was valided. Conclusion This method is convenient,fast and good reproducibility, it can be used determination of residual DNA in recombinant insulin aspart .
[Key words] Fluorescence method;Residual exogenous DNA;Insulin aspart;Quality control
门冬胰岛素是一种新型的人胰岛素改构产物，通过基因工程重组技术、利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物。该药物可在体内迅速起效产生降血糖的作用，有效地控制糖尿病患者的餐后血糖[1]。根据重组生物技术产品安全性评价的要求，产品中外源性DNA残留量的检测是一个重要项目，必须纳入质量标准中进行控制。2010年版《中国药典》三部附录收载了2种外源性DNA残留检测方法：DNA杂交法和荧光法。DNA杂交法是利用宿主DNA标记探针，与样品中外源性DNA特异性进行杂交，定性检查宿主DNA残留；荧光法是利用高灵敏度荧光染料与双链DNA结合形成复合物，在激发后可产生强荧光信号，在一定范围内荧光信号与DNA浓度成正比，因而可定量检查DNA的残留量。DNA杂交法操作周期较长，干扰因素多，重复性较差，不能进行定量分析，此外还需药品生产企业提供宿主菌DNA作为模板，因而有很大的局限性[2]。荧光法操作简单、快捷，且不需要宿主DNA作为模板，因而可广泛用于重组蛋白药物残余外源性DNA的检测。本研究运用荧光检测法对门冬胰岛素原料药中外源性DNA残留量进行检测，并进行了方法学验证，报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Spectra Max Gemini XS荧光酶标仪（Molecular Devices公
司）；饱和酚溶液（北京欣经科生物技术有限公司）；Quant-iTTM PicoGreendsDNA Assay Kit试剂盒（Invitrogen Molecular Probes公司）。
1.2 供试品
三批门冬胰岛素原料，为本室留样检品。
1.3 方法
1.3.1 供试品的处理方法
1.3.1.1 样品稀释法处理 以1.5 mg门冬胰岛素为1剂量计，用TE缓冲液分别配制浓度为4.0、2.0、1.0、0.5、0.1剂量/mL的样品溶液和加样回收溶液。
1.3.1.2 蛋白酶K消化法处理 分别取2.0、1.0、0.5剂量/mL的样品，加入终浓度为0.1 mg/mL的蛋白酶K溶液，混匀后37℃处理4 h，作为供试品进行测定，同时制备加样回收溶液。
1.3.1.3 酚氯仿法处理 取待处理的DNA标准品溶液、供试品溶液及供试品PPC，加入等体积的饱和酚溶液，充分振摇，10 000 rpm离心10 min；取上层水相，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（24∶1），充分振摇，同上离心，取上层水相；于通风橱中将残留氯仿挥发干净。
1.3.2 测定方法 取稀释法、蛋白酶K消化法及酚氯仿法处理的DNA标准溶液、供试品溶液及供试品加样回收溶液各400 μL于1.5 mL离心管中，加等体积荧光染料混匀，室温避光放置5 min。取250 μL于黑色酶标板中，每个样品平行三复孔。将加好样品的酶标板置于荧光酶标仪上，在激发波长480 nm、发射波长520 nm下测定荧光强度。数据用SoftMax PRO软件分析，作图并求得回归方程。
1.3.3 DNA标准曲线的建立 分别取500 μL，加BSA溶液100 μL，使DNA标准品终浓度为0、5、10、20、30、40、60、80 ng/mL。非酚氯仿法处理：取标准DNA溶液，用TE缓冲液分别稀释至0、5、10、20、30、40、60、80 ng/mL。酚氯仿法处理：取标准DNA溶液，用TE缓冲液分别稀释至0、6、12、24、36、48、72、96 ng/mL。
1.3.4 方法学验证
1.3.4.1 精密度 以供试品浓度为2剂量/mL，按20 ng/mL浓度加入标准DNA制备加样回收样品，平行制备7份加样回收样品分别进行测定。
1.3.4.2 准确性 （1）不同加样浓度的加样回收率：对2剂量/mL的供试品浓度分别进行了15、20、25 ng/mL浓度的加样回收率及样品DNA残留测定。（2）不同供试品浓度的加样回收率：分别研究了1剂量/mL和2剂量/mL两个供试品浓度的外源性DNA测定，以20 ng/mL 加样浓度制备加样回收样品，测定两个供试品浓度下的加样回收率。
1.3.5 三批供试品测定 将供试品制成2剂量/mL浓度，同时按20 ng/mL浓度制备每批供试品的加样回收样品，对三批供试品及加样回收样品进行测定。
2 结果
2.1 供试品处理方法
样品稀释法和蛋白酶K消化法的试验结果发现样品可能存在干扰，两种处理方法下的精密度和加样回收率都不能满足实验测定要求，表明该方法不适合本品的外源性DNA测定。采用酚氯仿法处理样品，供试品和加样回收样品都没有出现干扰，精密度、加样回收率等均能很好地满足实验测定要求，表明酚氯仿法处理样品适合于本品的DNA残留测定。
2.2 标准曲线
以荧光读数的平均值（n=3）对DNA含量作标准曲线回归方程，不用酚氯仿法处理和用酚氯仿法处理的标准曲线分别为：y=48.137+5.611x和y=50.996+4.338x，在0～80 ng/mL浓度范围内均呈线性相关，相关系数γ2均为0.999。考虑到酚氯仿处理后样品中的DNA有少量损失，标准DNA的制备应与供试品一致，以消除样品处理损失带来的误差。因此后续的研究中标准曲线都采用酚氯仿法处理的标准DNA。
2.3 精密度
7份平行样品的加样回收结果分别为82%、87%、85%、86%、81%、85%、85%，7次平行处理的样品加样回收率平均值为84%，其RSD为2.5%，表明该法的方法精密度良好。此外各个样品的平行三复孔的加样回收率的RSD平均值为2.3%，表明该法测定的仪器精密度良好，能满足实验测定要求。
2.4 回收率测定
2.4.1 不同加样浓度的加样回收率测定结果 加样浓度15 ng/mL的加样回收率为105%、20 ng/mL为105%、25 ng/mL为97%。在各个浓度下的加样回收率均在80%～120%之间，表明该法能准确测定供试品中DNA的残留量。
2.4.2 不同供试品浓度的加样回收率测定结果 供试品浓度1剂量/mL和2剂量/mL的加样回收率分别为97%和105%，结果表明在两个浓度下的供试品都具有良好的加样回收率，均符合系统适用性要求。
2.5 三批供试品测定结果
对三批供试品分别进行了3次重复试验，测定结果见表1。结果表明3次重复实验测定的三批供试品测定结果一致，重现性较好。加样回收率均在80%～120%之间，表明测定结果准确。供试品测定结果均低于5 ng/mL，即供试品中的残留DNA含量均低于2.5 ng/mL剂量。
3 讨论
在2010版中国药典实施之前，外源性DNA残留的检测都是采用地高辛标记探针的杂交法来完成的，由于杂交法自身的局限性，需研究要更为准确可靠的方法。荧光染料法在很大程度上可以弥补杂交法的局限性，很适合重组产品的残留DNA测定。荧光法的基本原理是依据荧光染料PicoGreen能够与双链DNA结合形成复合物，在波长480 nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520 nm处进行检测，在一定的DNA 浓度范围内以及该荧光染料过量的情况下，荧光信号与DNA浓度成正比[3-4]。荧光法可以不区分宿主菌来源，能够检测出重组制品中全部DNA 污染。
本研究参考《中国药典》DNA残留测定中的荧光染色法及相关资料方法，建立了门冬胰岛素中残留DNA的测定方法。研究中发现对样品的处理方法很关键，当样品中存在高浓度的蛋白时，有可能会干扰荧光染料和DNA的结合而影响实验结果的准确性。笔者在对门冬胰岛素的研究中发现单纯的样品稀释以及蛋白酶K法消化都不能很好的消除样品中的干扰，而利用酚氯仿抽提法则可以很好去除样品干扰，同时具有良好的加样回收率，表明测定结果准确可靠。笔者对建立的方法进行了方法学研究，结果表明该方法在DNA 含量0～80 ng/mL范围内线性良好，并有很好的精密度和加样回收率，测定结果准确可靠。此外对三批门冬胰岛素原料分别进行了3次外源性DNA残留量测定，加样回收率和测定结果均很一致，表明该法可用于门冬胰岛素原料外源性DNA残留量的质量控制。本研究结果也可以指导其他重组胰岛素及其类似物外源性DNA残留量的检测方法的建立。
[参考文献]
[1] 杨妤欣，陈隽.门冬胰岛素类似物研究概况[J].第三军医大学学报，2005，27（3）：270-272.
[2] 王军志.生物技术药物研究开发和质量控制[M].第2版.北京：科学出版社，2007：98.
[3] 饶春明，赵阳，李永红，等.应用荧光法测定重组细胞因子中残余DNA含量[J].药物分析杂志，2005，25（12）：1417-1419.
[4] 王兰，高凯，毕华，等.荧光法和DNA杂交法检测重组技术产品中残余DNA的比较[J].药物分析杂志，2009，29（7）：1063-1066.
（收稿日期：2012-01-06）