论文部分内容阅读
【摘要】目的: 针对不同种属（小鼠、大鼠、人）的myocardin序列进行比对，并通过理化性质分析，在同源区域中选择兼具备抗原性和亲水性较强的基因片段，构建重组质粒。方法: 通过聚合酶链反应(PCR)以Q935为模板制备 Myocardin目的基因 ,通过pET22b载体线性化以及连接、 转化等方法构建原核表达载体pET22b-MyocardinN,并通过酶切和测序对其序列进行鉴定。结果 正确构建了原核重组表达质粒pET22b-MyocardinN,基因测序结果表明,与NCBI的小鼠Myocardin已知序列完全一致。结论 成功构建的原核重组表达载体pET22b-MyocardinN,为后续蛋白表达，制备可抗多种属Myocardin的抗体提供了基础。
【关键词】亲水区 聚合酶链反应 myocardin 基因克隆
Construction Of The Prokaryotic Expression Plasmid Of Myocardin Hydrophilic Region Gene
GUO Yu-tingren guangda
(Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Bioengineering, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)
【Abstract】Objective From comparison of myocardin DNA sequence of different species（mouse、rat、human），to select a homologous sequence with higher antigenicity and hydrophilicity through physico-chemical properties analysis，and apply it to the construction of recombinant plasmid. Methods MyocardinN gene was obtained by PCR. Q935 was used as cloning template and linearization of carrier plasmid pET22b, conjunction and conversion were done. At last, for assessment, the product was sequenced. Results The prokaryotic expression plasmid pET22b-MyocardinN was correctly constructed. DNA sequencing results showed that the sequence of MyocardinN gene in positing clones was as completely same as the mouse myocardin sequence reported by NCBI. Conclusion Prokaryotic expression plasmid pET22b-MyocardinN is successfully constructed .These lay a foundation for further prokaryotic expression and preparation of antibodies against myocardin of different species.
【Keywords】hydrophilic region ；PCR；myocardin；gene clone
Myocardin是一种心肌和平滑肌特异性的血清应答因子(SRF)的辅助因子[1]，作用于早期心脏形成，还表达于血管平滑肌，这其中包括主動脉、 肺流出道、 胃肠及生殖泌尿道的平滑肌[2]。myocardin及其家族协同其他转录因子在细胞生长、迁移及肌形成中起着重要的调控作用[3]，其活性的改变与人类主要心血管疾病如动脉粥样硬化、 心肌肥大、 高血压的发生发展关系非常密切。因此，对不同种属（小鼠、大鼠、人）的myocardin序列进行比对，选择同源的亲水区与载体构建质粒，旨在进一步表达制备抗体，以广泛应用于myocardin相关转录调控机制的研究。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒和菌株：pET22b Q935质粒模板 工程菌DH5α
1.1.2主要试剂：Pfu酶、限制性内切酶EcoRI、XhoI购自索莱宝公司； T4 DNA连接酶购自biolabs公司；胶回收DNA纯化试剂盒购自generay公司。
1.2方法
1.2.1引物设计：通过对小鼠、大鼠和人的myocardin序列进行比对，通过Anthe_2000软件对其相应氨基酸序列的理化性质进行分析，选择兼具备抗原性和亲水性较好的myocardin同源亲水区（aa97-270）序列，设计引物，引物序列如下：P1:5’-GCGAATTCGATGAAGCTGAAAAGAGCCCGACTC, P2:3’-CGCTCGAGCTACTTCTGGTCTGGGGGGAT
GTACTG
预期扩增序列长度为522bp,不含酶切位点。为了能顺利进行克隆,在引物中引入了上游酶切位点EcoRI(GAA TTC)和下游酶切位点XhoI(CTC GAG)。
引物由Invitrogen公司合成,构建后的重组质粒也由该公司测序验证完全正确。
1.2.2PCR反应反应体系为：5.0μl 10×Pfu Buffer，1.5μl 10mM dNTP,1.0μl Q质粒模板（稀释10倍），1.0μl引物P1，1.0μl引物P2, Pfu 酶1.0μl，,最后加超纯水至50μl。
反应条件为: 94℃变性5min(1个循环)；94℃变性1min,55℃复性 1min,72 ℃延伸 1.5min(30个循环) ;30 个循环后,72 ℃ 延伸 10min。
1.2.3重组子pET22b-myocardinN的构建及序列分析胶回收 PCR产物 ,用EcoRI和XhoI双酶切pET22b和PCR纯化物,将酶切产物进行电泳，胶回收，将回收后酶切产物在T4 DNA连接酶作用下进行连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细菌 ,铺在加氨苄西林的LB平板上 ,37℃生长过夜。挑取阳性克隆扩增培养 ,收集菌体 ,按照常规方法小量抽提质粒 ,重组质粒以EcoRI和XhoI双酶切鉴定。送Invitrogen公司进行测序鉴定。将测序结果与NCBI小鼠myocardin序列及pET22b载体进行核苷酸同源性分析。
2图
【关键词】亲水区 聚合酶链反应 myocardin 基因克隆
Construction Of The Prokaryotic Expression Plasmid Of Myocardin Hydrophilic Region Gene
GUO Yu-tingren guangda
(Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Bioengineering, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)
【Abstract】Objective From comparison of myocardin DNA sequence of different species（mouse、rat、human），to select a homologous sequence with higher antigenicity and hydrophilicity through physico-chemical properties analysis，and apply it to the construction of recombinant plasmid. Methods MyocardinN gene was obtained by PCR. Q935 was used as cloning template and linearization of carrier plasmid pET22b, conjunction and conversion were done. At last, for assessment, the product was sequenced. Results The prokaryotic expression plasmid pET22b-MyocardinN was correctly constructed. DNA sequencing results showed that the sequence of MyocardinN gene in positing clones was as completely same as the mouse myocardin sequence reported by NCBI. Conclusion Prokaryotic expression plasmid pET22b-MyocardinN is successfully constructed .These lay a foundation for further prokaryotic expression and preparation of antibodies against myocardin of different species.
【Keywords】hydrophilic region ；PCR；myocardin；gene clone
Myocardin是一种心肌和平滑肌特异性的血清应答因子(SRF)的辅助因子[1]，作用于早期心脏形成，还表达于血管平滑肌，这其中包括主動脉、 肺流出道、 胃肠及生殖泌尿道的平滑肌[2]。myocardin及其家族协同其他转录因子在细胞生长、迁移及肌形成中起着重要的调控作用[3]，其活性的改变与人类主要心血管疾病如动脉粥样硬化、 心肌肥大、 高血压的发生发展关系非常密切。因此，对不同种属（小鼠、大鼠、人）的myocardin序列进行比对，选择同源的亲水区与载体构建质粒，旨在进一步表达制备抗体，以广泛应用于myocardin相关转录调控机制的研究。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒和菌株：pET22b Q935质粒模板 工程菌DH5α
1.1.2主要试剂：Pfu酶、限制性内切酶EcoRI、XhoI购自索莱宝公司； T4 DNA连接酶购自biolabs公司；胶回收DNA纯化试剂盒购自generay公司。
1.2方法
1.2.1引物设计：通过对小鼠、大鼠和人的myocardin序列进行比对，通过Anthe_2000软件对其相应氨基酸序列的理化性质进行分析，选择兼具备抗原性和亲水性较好的myocardin同源亲水区（aa97-270）序列，设计引物，引物序列如下：P1:5’-GCGAATTCGATGAAGCTGAAAAGAGCCCGACTC, P2:3’-CGCTCGAGCTACTTCTGGTCTGGGGGGAT
GTACTG
预期扩增序列长度为522bp,不含酶切位点。为了能顺利进行克隆,在引物中引入了上游酶切位点EcoRI(GAA TTC)和下游酶切位点XhoI(CTC GAG)。
引物由Invitrogen公司合成,构建后的重组质粒也由该公司测序验证完全正确。
1.2.2PCR反应反应体系为：5.0μl 10×Pfu Buffer，1.5μl 10mM dNTP,1.0μl Q质粒模板（稀释10倍），1.0μl引物P1，1.0μl引物P2, Pfu 酶1.0μl，,最后加超纯水至50μl。
反应条件为: 94℃变性5min(1个循环)；94℃变性1min,55℃复性 1min,72 ℃延伸 1.5min(30个循环) ;30 个循环后,72 ℃ 延伸 10min。
1.2.3重组子pET22b-myocardinN的构建及序列分析胶回收 PCR产物 ,用EcoRI和XhoI双酶切pET22b和PCR纯化物,将酶切产物进行电泳，胶回收，将回收后酶切产物在T4 DNA连接酶作用下进行连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细菌 ,铺在加氨苄西林的LB平板上 ,37℃生长过夜。挑取阳性克隆扩增培养 ,收集菌体 ,按照常规方法小量抽提质粒 ,重组质粒以EcoRI和XhoI双酶切鉴定。送Invitrogen公司进行测序鉴定。将测序结果与NCBI小鼠myocardin序列及pET22b载体进行核苷酸同源性分析。
2图