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摘要：目的： 探讨抑制性神经元的表达改变在FMR1基因敲除鼠癫痫发病机制的作用。方法：应用免疫组织化学染色检测2 周龄FMR1基因敲除型（KO）和同龄野生型（WT）小鼠海马抑制性神经元数目（Glutamic acid decarboxylase （GAD） and parvalbumin（PV）阳性神经元）；应用Western blot法检测上述小鼠海马组织GAD和PV的含量。结果：FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD神经元数目的比较：FMR1 KO鼠海马GAD神经元81±20.134，WT鼠96.11±15.186，差异具有统计学意义（P=0.006）；CA1区FMR1 KO鼠33.24±7.710，WT鼠40.59±5.738，差異具有统计学意义（P=0.001）；CA3区FMR1 KO鼠30.94±11.028，WT鼠36.06±6.432差异具有统计学意义（P=0.041）；DG区FMR1 KO鼠17.82±5.703， WT鼠21.44±3.245，差异不具有统计学意义（P=0.0669）； FMR1 KO鼠和WT鼠的GAD65.67的蛋白水平的比较，GAD65： t=5.152，P=0.000；GAD67： t=4.723，P=0.000， FMR1 KO鼠的GAD65.67的蛋白水平均高于WT鼠。FMR1 KO鼠和WT鼠海马PV阳性神经元数目的比较：FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD神经元数目的比较：FMR1 KO鼠海马PV阳性神经元77±16.321，WT鼠90.13±13.126，差异具有统计学意义（P=0.005）；CA1区FMR1 KO鼠24.13±6.635，WT鼠35.63±6.635，差异具有统计学意义（P=0.002）；CA3区FMR1 KO鼠25.94±9.123，WT鼠30.12±5.357差异具有统计学意义（P=0.038）；DG区FMR1 KO鼠14.73±4.473， WT鼠16.12±3.149，差异不具有统计学意义（P=0.068）； KO小鼠海马中PV表达量分别较WT小鼠减少，KO鼠0.132±0.011，WT鼠0.155±0.013，差异有统计学意义（P=0.0386）。结论：FMR-1KO小鼠海马抑制性神经元数目的减少以及PV蛋白表达减低，可能是诱发该种小鼠癫痫发病率高重要原因。KO鼠GAD表达增高，考虑和KO鼠代偿性增高有关。
关键词 ：脆性X综合征；抑制性神经元；癫痫；谷氨酸脱羧酶； 小白蛋白
中图分类号：R54 文献标识码： A 文章编号：
深圳市科技计划项目 项目编号 201303187 FMR1基因敲除鼠PV阳性神经元变化及其癫痫发病机制的研究
Abstract ： Objective.This study focused on the expression differences of Glutamic acid decarboxylase （GAD） and parvalbumin（PV） expression between FMR1KO and wild-type （WT） mice in hippocampus. Methods. 2 weeks mice were randomly obtained for immunohistochemistry and Western blotting to detect the expression.Results Number of GAD interneurons in hippocampus ： FMR1 KO mice81±20.134，WT mice 96.11±15.186 （P=0.006）； CA1： FMR1 KO mice33.24±7.710， WT mice 40.59±5.738（P=0.001）； CA3： FMR1 KO mice 30.94±11.028，WT mice 36.06±6.432 （P=0.041）； DG： FMR1 KO mice 17.82±5.703， WT mice 21.44±3.245 （P=0.0669）； The expressions of GAD65 and GAD67 were significantly increased in the hippocampus tissues in FMR-1KO when compaired to that in WT mice （P=0.000）.Number of parvalbumin（PV）-expressing interneuron in hippocampus ： FMR1 KO mice 77±16.321，WT mice 90.13±13.126 （P=0.005）； CA1： FMR1 KO mice 24.13±6.635， WT mice 35.63±6.635（P=0.002）； CA3： FMR1 KO mice 25.94±9.123，WT mice 30.12±5.357 （P=0.038）； DG： FMR1 KO mice14.73±4.473， WT mice16.12±3.149 （P=0.068）； The expressions of PV were reduced in the hippocampus tissues in FMR-1KO when compaired to that in WT mice （P=0.0386）.Conclusion The decreased number of inhibitory interneurons in the hippocampus of FMR1 KO mice demonstrates that interneurons is possible to play an critical role in increased susceptibility to epileptic seizures of FXS.Increased expression of GAD of KO mice is compensatory. Keywords：Fragile X syndrome； interneurons； Epilepsy； Glutamic acid decarboxylase
脆性X综合征FXS（Fragile X syndrome，FXS）是最常见的遗传性智力低下疾病之一，它是一种外显率不完全的X-连锁遗传病（1），最初由细胞遗传学检查发现X染色体上存在脆性位点而得名，男性发病率明显高于女性，临床突出表现为中至重度的智力发育障碍，脸狭长及下颌突出等典型面部特征，以及青春期后的巨大睾丸，同时伴有适应能力下降、孤独样症状等异常行为，患者可出现癫痫发作，探索其发病机制及药物治疗途徑是目前国际上研究的热点问题。[1]FMR1 KO鼠的许多行为学表现与脆性X综合征患者非常相似，最明显的包括自发活动增加、旷场习惯能力下降、听源性惊厥易感性增强 [2]。神经环路中兴奋性与抑制性功能的协调平衡对维持正常大脑的整体功能是必要的，GAD神经元抑制系统的减弱与癫痫相关[3]。Leah Selby等在一周岁KO鼠中研究发现GABA能中间神经元的变化[4]。本研究拟通过研究抑制性神经元的改变，为脆性X综合征的癫痫发病机制提供进一步的依据，为人们认识脆性X综合征的发病机制打下基础。
1 材料与方法
1.材料
1.1 实验动物及分组
FMR1基因敲除型（KO）纯合子（-/-）及其野生型（WT）纯合子（+/+）FVB近交系小鼠由荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心Oostra BA 教授惠赠。实验前取鼠尾巴进行PCR和Western Blot进行基因型鉴定。
2.方法
2.1免疫组化漂浮法：将FVB小鼠350mg/kg水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定脑组织，常规脱水、冰冻切片，漂洗盒孔内注入PBS，各取保存于PBS中的切片6-9片放入孔内。用PBS换洗3次，每次5分钟。每片加1滴（50ul）过氧化物酶阻断剂（S-P试剂盒中A液），室温下置振荡器振荡孵育30分钟后，用PBS换洗3次。每片加1滴（50ul）正常非特异性血清（S-P试剂盒中B液），室温下置振荡器振荡孵育60分钟后，每片加100ul 一抗（ GAD 1∶400 PV1：8000以0.2%Triton液稀释） ，室温下振荡器振荡60分钟后放入4℃冰箱中，孵育过夜。PBS冲洗7次，吸干孔内残余液体，每片加1滴（50ul）生物素标记的二抗（C液），室温下振荡孵育60分钟。PBS冲洗3次，吸干孔内残余液体，每片加1滴（50ul）链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（D液），室温下振荡器振荡孵育30分钟。PBS冲洗3次，吸干孔内残余液体，DAB液显色，显微镜下观察显色结果，3-5分钟用PBS液终止反应，PBS换洗3次，将切片贴于明胶处理过的载玻片上，自然晾干，脱水透明，中性树胶封片。空白对照实验：用PBS代替一抗，其余步骤不变。
2.2 Western Blot法：用RIPA常规提取皮层、海马组织的蛋白。15%变性聚丙烯酰胺分离凝胶分离（120V，90分钟），采用PVDF膜恒压100V转膜60分钟， 5%脱脂奶粉溶液封闭膜1h，加入TTBS稀释的一抗（FMRP 1：1000；PV 1：16000；GAD 1：32000；抗β-actin抗体1：2000），4℃孵育轻摇过夜。加入二抗（抗鼠抗体1：4000，抗兔抗体1：4000），室温下与膜孵育1h（轻摇），ECL发光液孵育，x光胶片曝光显影并进行扫描。
3.数据采集和统计
使用SPSSl7.0 for Windows软件包（SPSS lnc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析，两样本均数比较采用t检验。以P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 FMR1 KO鼠海马GAD神经元数目的变化
FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD神经元数目的比较：FMR1 KO鼠海马GAD神经元81±20.134，WT鼠96.11±15.186，差异具有统计学意义（P=0.006）；CA1区FMR1 KO鼠33.24±7.710，WT鼠40.59±5.738，差异具有统计学意义（P=0.001）；CA3区FMR1 KO鼠30.94±11.028，WT鼠36.06±6.432差异具有统计学意义（P=0.041）；DG区FMR1 KO鼠17.82±5.703， WT鼠21.44±3.245，差异不具有统计学意义（P=0.0669）（见表1）
表1 FMR1 KO和WT鼠海马GAD神经元数目比较
2.2 海马组织GAD蛋白表达的变化
WT鼠和FMR1 KO鼠海马组织GAD蛋白的表达量
FMR1 KO鼠和WT鼠的GAD65.67的蛋白水平的比较，GAD65： t=5.152，P=0.000；GAD67： t=4.723，P=0.000， FMR1 KO鼠的GAD65.67的蛋白水平均高于WT鼠。（见表2 图1）
表2 WT鼠和FMR1 KO鼠海马组织GAD蛋白的表达量
FMR1 KO鼠的GAD65和GAD67的蛋白水平均高于WT鼠，*P<0.05
图1 WT鼠和FMR1 KO鼠GAD65 67蛋白印迹
2.3 KO与WT小鼠脑组织PV阳性中间神经元数的表达
FMR1 KO鼠和WT鼠海马PV阳性神经元数目的比较：FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD神经元数目的比较：FMR1 KO鼠海马PV阳性神经元77±16.321，WT鼠90.13±13.126，差异具有统计学意义（P=0.005）；CA1区FMR1 KO鼠24.13±6.635，WT鼠35.63±6.635，差异具有统计学意义（P=0.002）；CA3区FMR1 KO鼠25.94±9.123，WT鼠30.12±5.357差异具有统计学意义（P=0.038）；DG区FMR1 KO鼠14.73±4.473， WT鼠16.12±3.149，差异不具有统计学意义（P=0.068）（见表3） 表3 FMR1 KO和WT鼠海馬PV阳性神经元数目比较
2.4 WT鼠和FMR1 KO鼠海马组织PV蛋白的表达量
KO小鼠海马中PV表达量分别较WT小鼠减少，KO鼠0.132±0.011，WT鼠0.155±0.013，差异有统计学意义（P=0.0386）。（见图2）
图2 KO与WT小鼠脑组织PV蛋白的表达
3 讨论
既往国内外众多的研究发现脆性X综合征患者癫痫的发生率明显增高，Berry等研究发现FXS癫痫发作类型以复杂部分性发作居多，少数表现为简单部分性运动发作或，全面性发作，且以额叶和颞叶癫痫为主 [5-7]。在动物模型上，较多研究发现该模型小鼠具有点检易感性，熊志奇等研究通过电刺激小鼠杏仁核，发现KO鼠癫痫易感性明显增强，在进一步的研究中发现FMRP的缺失是其发生癫痫的重要的原因[8]。Musumeci等国外研究也发现将FMR1 KO鼠FMR1 KO鼠癫痫严重度评分均比同龄WT鼠高[9，10]。上述临床和基础研究均提示FXS具有癫痫易感性，但具体机制尚不明确。
目前众多研究发现，抑制性神经元和兴奋性神经元的递质平衡失调是癫痫的启动原因，GABA是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，其合成与代谢的关键酶分别为L-谷氨酸脱羧酶（L-glutamic acid，GAD）和GABA转氨酶（GABA transaminase，GABA-T）。GAD 是催化Glu 脱羧形成抑制性神经递质 GABA 的限速酶，GAD 在脑内神经元有两种异构酶 GAD65 和 GAD67，它们的分子量分别为 65KD 和 67KD，分别由不同的基因编码，氨基酸序列的表达与调节也不同。GAD67 维持 GABA的基础水平，满足抑制性神经递质的基本功能需要；而 GAD65 增加 GABA 的量，满足对侧枝网络神经兴奋性控制的需要[11]，抑制性神经通常为GAD表达的神经元。PV特异性地分布于中枢神经系统少数神经元的胞体、树突及轴突。普遍认为PV阳性神经元是抑制性神经元的主要亚群。PV阳性神经元的表达减少，可导致癫痫的发生[12]。因此，PV阳性中间神经元在癫痫发病中的作用受到关注。
本研究用免疫组织化学染色方法观察了两种小鼠海马脑片的GAD标记的神经元和PV阳性 进行计数，发现FMR1KO鼠GAD标记的神经元计数和PV阳性神经元明显低于WT鼠， 差异具有统计学意义； Selby等在2007年对FMR1 KO鼠和WT鼠抑制性中间神经元进行研究，发现一年龄FMR1 KO鼠在大脑皮层PV阳性的神经元数目低于WT鼠，但其面积却大于WT鼠，而CB、CK等其它类型如中间神经元没有变化 [4]。目前众多研究显示：海马中间神经元数目的减少，使得其对颗粒细胞或者锥体神经元的抑制下降，从而导致颞叶性癫痫的发生[13-15]。本研究更详细的研究了GAD神经元和PV阳性神经元，进一步提示抑制性神经元的减少可能是KO鼠癫痫发生的重要启动因素。本研究抑制性神经元的减少，主要是PV阳性神经元的减少，PV阳性神经元的改变，可能是其癫痫易感性增加的主要机制。
目前关于FMR1 KO鼠抑制性神经元数目降低的原因尚不清楚， Selby等认为可能和神经营养因子BNDF对其神经元的发育调控有关，具体机制目前还不清楚[4]。本研究KO鼠海马齿状回PV阳性中间神经元和GAD神经元数量和WT鼠无改变，根据既往研究，推测齿状回与抑制神经兴奋性扩散关系不大，而可能是通过苔藓纤维发芽与异常的突触连接形成参与癫痫的形成。 在进一步的研究中发现，GAD和PV的蛋白印记的表达不同。KO小鼠海马中PV表达量分别较WT小鼠减少，P=0.0386，差异有统计学意义。目前其表达改变的原因不详，既往的研究发现脑源性神经营养因子通过作用于TrkB调节PV阳性神经元的发育及功能，脑源性神经营养因子表达增加，使得PV表达的减少，进而引起其癫痫的发生[16]。众多研究发现敲除BDNF、TrkB后发现该模型的小鼠癫痫的发生率明显增加 [17-18]。FMRP是一种RNA结合蛋白，参与调节核蛋白复合物组装、mRNAs出核运输、树突mRNAs定位、RNA及蛋白翻译过程调节等过程[19-22]。FMRP参与快速调控突触中新蛋白质合成，以适应频繁的突触连接变化，为学习和记忆过程提供物质基础[23]。FMR1KO小鼠由于FMRP的缺失，有可能使其对TrkBmRNA或蛋白负性调节作用减弱，导致脑内特定部位PV阳性神经元发育及功能异常。其机制需要进一步研究。
而本研究中发现KO鼠GAD表达较WT鼠增加。在既往的研究发现癫痫模型GAD表达增高，并认为这是一种机体的代偿[24-28]。他们认为癫痫，由于神经元的过度兴奋，需要产生更多的GABA来抑制其兴奋性，这就需要GAD的表达增高来代偿。然而GAD过度表达后，则反馈性的使得GABA能减少抑制作用；使得兴奋和抑制之间平衡进一步破坏，使得癫痫的易感性明显增加。但在小鼠生长发育期，究竟是GAD表达量的改变还是GAD神经元的数量及形态改变在癫痫的发病机制中占主导地位，仍需进一步研究。
综上所述，FMR1KO鼠癫痫易感性增加的原因之一可能是其抑制性神经元数目的减少，在进一步研究发现PV表达改变可能是其癫痫易感性的重要原因。GAD表达的增加，考虑是和其代偿机制有关。其机制需进一步实验验证。
参考文献：
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关键词 ：脆性X综合征；抑制性神经元；癫痫；谷氨酸脱羧酶； 小白蛋白
中图分类号：R54 文献标识码： A 文章编号：
深圳市科技计划项目 项目编号 201303187 FMR1基因敲除鼠PV阳性神经元变化及其癫痫发病机制的研究
Abstract ： Objective.This study focused on the expression differences of Glutamic acid decarboxylase （GAD） and parvalbumin（PV） expression between FMR1KO and wild-type （WT） mice in hippocampus. Methods. 2 weeks mice were randomly obtained for immunohistochemistry and Western blotting to detect the expression.Results Number of GAD interneurons in hippocampus ： FMR1 KO mice81±20.134，WT mice 96.11±15.186 （P=0.006）； CA1： FMR1 KO mice33.24±7.710， WT mice 40.59±5.738（P=0.001）； CA3： FMR1 KO mice 30.94±11.028，WT mice 36.06±6.432 （P=0.041）； DG： FMR1 KO mice 17.82±5.703， WT mice 21.44±3.245 （P=0.0669）； The expressions of GAD65 and GAD67 were significantly increased in the hippocampus tissues in FMR-1KO when compaired to that in WT mice （P=0.000）.Number of parvalbumin（PV）-expressing interneuron in hippocampus ： FMR1 KO mice 77±16.321，WT mice 90.13±13.126 （P=0.005）； CA1： FMR1 KO mice 24.13±6.635， WT mice 35.63±6.635（P=0.002）； CA3： FMR1 KO mice 25.94±9.123，WT mice 30.12±5.357 （P=0.038）； DG： FMR1 KO mice14.73±4.473， WT mice16.12±3.149 （P=0.068）； The expressions of PV were reduced in the hippocampus tissues in FMR-1KO when compaired to that in WT mice （P=0.0386）.Conclusion The decreased number of inhibitory interneurons in the hippocampus of FMR1 KO mice demonstrates that interneurons is possible to play an critical role in increased susceptibility to epileptic seizures of FXS.Increased expression of GAD of KO mice is compensatory. Keywords：Fragile X syndrome； interneurons； Epilepsy； Glutamic acid decarboxylase
脆性X综合征FXS（Fragile X syndrome，FXS）是最常见的遗传性智力低下疾病之一，它是一种外显率不完全的X-连锁遗传病（1），最初由细胞遗传学检查发现X染色体上存在脆性位点而得名，男性发病率明显高于女性，临床突出表现为中至重度的智力发育障碍，脸狭长及下颌突出等典型面部特征，以及青春期后的巨大睾丸，同时伴有适应能力下降、孤独样症状等异常行为，患者可出现癫痫发作，探索其发病机制及药物治疗途徑是目前国际上研究的热点问题。[1]FMR1 KO鼠的许多行为学表现与脆性X综合征患者非常相似，最明显的包括自发活动增加、旷场习惯能力下降、听源性惊厥易感性增强 [2]。神经环路中兴奋性与抑制性功能的协调平衡对维持正常大脑的整体功能是必要的，GAD神经元抑制系统的减弱与癫痫相关[3]。Leah Selby等在一周岁KO鼠中研究发现GABA能中间神经元的变化[4]。本研究拟通过研究抑制性神经元的改变，为脆性X综合征的癫痫发病机制提供进一步的依据，为人们认识脆性X综合征的发病机制打下基础。
1 材料与方法
1.材料
1.1 实验动物及分组
FMR1基因敲除型（KO）纯合子（-/-）及其野生型（WT）纯合子（+/+）FVB近交系小鼠由荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心Oostra BA 教授惠赠。实验前取鼠尾巴进行PCR和Western Blot进行基因型鉴定。
2.方法
2.1免疫组化漂浮法：将FVB小鼠350mg/kg水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定脑组织，常规脱水、冰冻切片，漂洗盒孔内注入PBS，各取保存于PBS中的切片6-9片放入孔内。用PBS换洗3次，每次5分钟。每片加1滴（50ul）过氧化物酶阻断剂（S-P试剂盒中A液），室温下置振荡器振荡孵育30分钟后，用PBS换洗3次。每片加1滴（50ul）正常非特异性血清（S-P试剂盒中B液），室温下置振荡器振荡孵育60分钟后，每片加100ul 一抗（ GAD 1∶400 PV1：8000以0.2%Triton液稀释） ，室温下振荡器振荡60分钟后放入4℃冰箱中，孵育过夜。PBS冲洗7次，吸干孔内残余液体，每片加1滴（50ul）生物素标记的二抗（C液），室温下振荡孵育60分钟。PBS冲洗3次，吸干孔内残余液体，每片加1滴（50ul）链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（D液），室温下振荡器振荡孵育30分钟。PBS冲洗3次，吸干孔内残余液体，DAB液显色，显微镜下观察显色结果，3-5分钟用PBS液终止反应，PBS换洗3次，将切片贴于明胶处理过的载玻片上，自然晾干，脱水透明，中性树胶封片。空白对照实验：用PBS代替一抗，其余步骤不变。
2.2 Western Blot法：用RIPA常规提取皮层、海马组织的蛋白。15%变性聚丙烯酰胺分离凝胶分离（120V，90分钟），采用PVDF膜恒压100V转膜60分钟， 5%脱脂奶粉溶液封闭膜1h，加入TTBS稀释的一抗（FMRP 1：1000；PV 1：16000；GAD 1：32000；抗β-actin抗体1：2000），4℃孵育轻摇过夜。加入二抗（抗鼠抗体1：4000，抗兔抗体1：4000），室温下与膜孵育1h（轻摇），ECL发光液孵育，x光胶片曝光显影并进行扫描。
3.数据采集和统计
使用SPSSl7.0 for Windows软件包（SPSS lnc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析，两样本均数比较采用t检验。以P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 FMR1 KO鼠海马GAD神经元数目的变化
FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD神经元数目的比较：FMR1 KO鼠海马GAD神经元81±20.134，WT鼠96.11±15.186，差异具有统计学意义（P=0.006）；CA1区FMR1 KO鼠33.24±7.710，WT鼠40.59±5.738，差异具有统计学意义（P=0.001）；CA3区FMR1 KO鼠30.94±11.028，WT鼠36.06±6.432差异具有统计学意义（P=0.041）；DG区FMR1 KO鼠17.82±5.703， WT鼠21.44±3.245，差异不具有统计学意义（P=0.0669）（见表1）
表1 FMR1 KO和WT鼠海马GAD神经元数目比较
2.2 海马组织GAD蛋白表达的变化
WT鼠和FMR1 KO鼠海马组织GAD蛋白的表达量
FMR1 KO鼠和WT鼠的GAD65.67的蛋白水平的比较，GAD65： t=5.152，P=0.000；GAD67： t=4.723，P=0.000， FMR1 KO鼠的GAD65.67的蛋白水平均高于WT鼠。（见表2 图1）
表2 WT鼠和FMR1 KO鼠海马组织GAD蛋白的表达量
FMR1 KO鼠的GAD65和GAD67的蛋白水平均高于WT鼠，*P<0.05
图1 WT鼠和FMR1 KO鼠GAD65 67蛋白印迹
2.3 KO与WT小鼠脑组织PV阳性中间神经元数的表达
FMR1 KO鼠和WT鼠海马PV阳性神经元数目的比较：FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD神经元数目的比较：FMR1 KO鼠海马PV阳性神经元77±16.321，WT鼠90.13±13.126，差异具有统计学意义（P=0.005）；CA1区FMR1 KO鼠24.13±6.635，WT鼠35.63±6.635，差异具有统计学意义（P=0.002）；CA3区FMR1 KO鼠25.94±9.123，WT鼠30.12±5.357差异具有统计学意义（P=0.038）；DG区FMR1 KO鼠14.73±4.473， WT鼠16.12±3.149，差异不具有统计学意义（P=0.068）（见表3） 表3 FMR1 KO和WT鼠海馬PV阳性神经元数目比较
2.4 WT鼠和FMR1 KO鼠海马组织PV蛋白的表达量
KO小鼠海马中PV表达量分别较WT小鼠减少，KO鼠0.132±0.011，WT鼠0.155±0.013，差异有统计学意义（P=0.0386）。（见图2）
图2 KO与WT小鼠脑组织PV蛋白的表达
3 讨论
既往国内外众多的研究发现脆性X综合征患者癫痫的发生率明显增高，Berry等研究发现FXS癫痫发作类型以复杂部分性发作居多，少数表现为简单部分性运动发作或，全面性发作，且以额叶和颞叶癫痫为主 [5-7]。在动物模型上，较多研究发现该模型小鼠具有点检易感性，熊志奇等研究通过电刺激小鼠杏仁核，发现KO鼠癫痫易感性明显增强，在进一步的研究中发现FMRP的缺失是其发生癫痫的重要的原因[8]。Musumeci等国外研究也发现将FMR1 KO鼠FMR1 KO鼠癫痫严重度评分均比同龄WT鼠高[9，10]。上述临床和基础研究均提示FXS具有癫痫易感性，但具体机制尚不明确。
目前众多研究发现，抑制性神经元和兴奋性神经元的递质平衡失调是癫痫的启动原因，GABA是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，其合成与代谢的关键酶分别为L-谷氨酸脱羧酶（L-glutamic acid，GAD）和GABA转氨酶（GABA transaminase，GABA-T）。GAD 是催化Glu 脱羧形成抑制性神经递质 GABA 的限速酶，GAD 在脑内神经元有两种异构酶 GAD65 和 GAD67，它们的分子量分别为 65KD 和 67KD，分别由不同的基因编码，氨基酸序列的表达与调节也不同。GAD67 维持 GABA的基础水平，满足抑制性神经递质的基本功能需要；而 GAD65 增加 GABA 的量，满足对侧枝网络神经兴奋性控制的需要[11]，抑制性神经通常为GAD表达的神经元。PV特异性地分布于中枢神经系统少数神经元的胞体、树突及轴突。普遍认为PV阳性神经元是抑制性神经元的主要亚群。PV阳性神经元的表达减少，可导致癫痫的发生[12]。因此，PV阳性中间神经元在癫痫发病中的作用受到关注。
本研究用免疫组织化学染色方法观察了两种小鼠海马脑片的GAD标记的神经元和PV阳性 进行计数，发现FMR1KO鼠GAD标记的神经元计数和PV阳性神经元明显低于WT鼠， 差异具有统计学意义； Selby等在2007年对FMR1 KO鼠和WT鼠抑制性中间神经元进行研究，发现一年龄FMR1 KO鼠在大脑皮层PV阳性的神经元数目低于WT鼠，但其面积却大于WT鼠，而CB、CK等其它类型如中间神经元没有变化 [4]。目前众多研究显示：海马中间神经元数目的减少，使得其对颗粒细胞或者锥体神经元的抑制下降，从而导致颞叶性癫痫的发生[13-15]。本研究更详细的研究了GAD神经元和PV阳性神经元，进一步提示抑制性神经元的减少可能是KO鼠癫痫发生的重要启动因素。本研究抑制性神经元的减少，主要是PV阳性神经元的减少，PV阳性神经元的改变，可能是其癫痫易感性增加的主要机制。
目前关于FMR1 KO鼠抑制性神经元数目降低的原因尚不清楚， Selby等认为可能和神经营养因子BNDF对其神经元的发育调控有关，具体机制目前还不清楚[4]。本研究KO鼠海马齿状回PV阳性中间神经元和GAD神经元数量和WT鼠无改变，根据既往研究，推测齿状回与抑制神经兴奋性扩散关系不大，而可能是通过苔藓纤维发芽与异常的突触连接形成参与癫痫的形成。 在进一步的研究中发现，GAD和PV的蛋白印记的表达不同。KO小鼠海马中PV表达量分别较WT小鼠减少，P=0.0386，差异有统计学意义。目前其表达改变的原因不详，既往的研究发现脑源性神经营养因子通过作用于TrkB调节PV阳性神经元的发育及功能，脑源性神经营养因子表达增加，使得PV表达的减少，进而引起其癫痫的发生[16]。众多研究发现敲除BDNF、TrkB后发现该模型的小鼠癫痫的发生率明显增加 [17-18]。FMRP是一种RNA结合蛋白，参与调节核蛋白复合物组装、mRNAs出核运输、树突mRNAs定位、RNA及蛋白翻译过程调节等过程[19-22]。FMRP参与快速调控突触中新蛋白质合成，以适应频繁的突触连接变化，为学习和记忆过程提供物质基础[23]。FMR1KO小鼠由于FMRP的缺失，有可能使其对TrkBmRNA或蛋白负性调节作用减弱，导致脑内特定部位PV阳性神经元发育及功能异常。其机制需要进一步研究。
而本研究中发现KO鼠GAD表达较WT鼠增加。在既往的研究发现癫痫模型GAD表达增高，并认为这是一种机体的代偿[24-28]。他们认为癫痫，由于神经元的过度兴奋，需要产生更多的GABA来抑制其兴奋性，这就需要GAD的表达增高来代偿。然而GAD过度表达后，则反馈性的使得GABA能减少抑制作用；使得兴奋和抑制之间平衡进一步破坏，使得癫痫的易感性明显增加。但在小鼠生长发育期，究竟是GAD表达量的改变还是GAD神经元的数量及形态改变在癫痫的发病机制中占主导地位，仍需进一步研究。
综上所述，FMR1KO鼠癫痫易感性增加的原因之一可能是其抑制性神经元数目的减少，在进一步研究发现PV表达改变可能是其癫痫易感性的重要原因。GAD表达的增加，考虑是和其代偿机制有关。其机制需进一步实验验证。
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