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【摘要】 目的 采用高效液相色谱法测定双黄连颗粒中绿原酸的含量。方法 用外标一点法，Diamonsil ODS1 C18色谱柱，甲醇-水-冰醋酸（15∶85∶1）为流动相，流速为1.0 mL/min，λ=324 nm。结果 绿原酸在0.060～1.210 μg范围内呈良好线性，回归方程为Y=105 427X+586.43，r2=0.999 5，平均加样回收率为99.3%，RSD=0.82%（n=6）。结论 本方法简便、准确，专属性强，测定结果重复性好，为双黄连颗粒中绿原酸的定量分析提供了科学有效的方法。
【关键词】 双黄连颗粒；绿原酸；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish the method for detemining the content of chlorogenic acid in Shuanghuanglian Keli by HPLC. Methods Using Diamonsil ODS1 C18 column， with methanol-water-glacial acetic acid （15∶85∶1） as the mobile phase， detection wavelength as 324 nm and flow rate was 1.0 mL/min. Results The calibration curve was linear at the range of 0.060～1.210 μg for chlorogenic acid and the equation was Y=105 427X+586.43， r2=0.999 5. The average recovery was 99.3% and RSD was 0.82% （n=6）. Conclusion This method was simple， accurate and proper， and the reduplication of the result was good， which provide scientific quantitative analysis method of chlorogenic acid in Shuanghuanglian Keli.
Key words：Shuanghuanglian Keli；chlorogenic acid；HPLC；content determination
双黄连颗粒收载于2005年版《中华人民共和国药典》（一部）[1]，处方由金银花、黄芩、连翘组成，功能疏风解表、清热解毒，用于外感风热所致的感冒。金银花为方中君药。原标准中只收载了黄芩的含量测定方法，没有君药金银花的成分含量测定方法，因此，不能有效和全面地控制药品质量。为了更好地控制双黄连颗粒的质量，提高双黄连颗粒的质量标准，我们参照2005年版《中华人民共和国药典》（一部）中收载的双黄连片，采用高效液相色谱（HPLC）法对金银花的主要成分绿原酸进行了含量测定，并进行了方法学研究。现报道如下。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：SPD-10A日本岛津；紫外分光仪：上海康化生化仪器制造厂；超声波清洗器：SK3200H上海科导超声仪器有限公司。
绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号110753-200413，供含量测定用）；双黄连颗粒由河南百年康鑫药业有限公司提供（批号20081101、20081102、20081103）。其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水-冰醋酸（15∶85∶1）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为324 nm。理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于6 000[1]。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含60 μL的溶液，即得对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约0.4 g，精密称定，置于50 mL的量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理（功率135 W，频率59 kHz）20 min。放置至室温，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.2.3 阴性样品的测试 取缺金银花的样品，按供试品制备方法制备阴性样品后测定，在绿原酸相应位置无峰出现，说明阴性样品的其他成分无干扰。色谱图见图1。图1双黄连颗粒HPLC图谱 注：A.对照品；B.供试品；C.阴性样品2.3 线性关系的考察
取同一对照品溶液（60.51 μg/mL），分别精密吸取1、2.5、5、10、20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，绿原酸对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=105 427X+586.43，r2=0.999 5，表明绿原酸在0.060～1.210 μg之间呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验
取同一对照品溶液，重复进样6次，每次进样10 μL，测定绿原酸峰面积，结果RSD=0.14%，表明精密度良好。
2.5 重复性试验
取同一批号（批号20081101）供试品，按供试品溶液制备方法制备5份供试液，依法测定每份样品中绿原酸的含量。结果RSD=1.18%，表明本法重复性良好。
2.6 稳定性试验
取同一批号（批号20081101）供试品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h测定峰面积，RSD=0.76%（n=5）。表明制备的供试品溶液在8 h内稳定。
2.7 加样回收率试验
采用加样回收法。精密称取已知含量的同一批样品（批号20081101，含量为5.217 mg/g）0.2 g，置50 mL量瓶中，分别精密加入绿原酸对照品溶液（0.375 mg/mL）各3 mL，蒸干，按“2.2.2”项下方法制备供试液，照上述色谱条件测定。分别进样10 μL，测定绿原酸峰面积并计算绿原酸含量（见表1） 表1加样回收率试验结果，结果平均回收率为99.3%，RSD=0.82%（n=6）。
2.8 样品测定
对3批中试产品进行测定，结果见表2。表2样品测定结果
3 讨论
根据3批测定结果，每1 g含金银花以绿原酸（C16H18O9）计均不少于5.0 mg，考虑到药材产地、加工、运输、贮藏等因素的影响，药材中绿原酸也会有较大的差别，因此暂规定本品每1 g含金银花以绿原酸（C16H18O9）计，不得少于4.5 mg。
为了保证供试品中绿原酸提取完全，本试验对供试品超声处理时间进行了考察，分别超声处理10、20、30 min进行测定，测得样品中对应的绿原酸含量分别为4.56、5.18、5.20 mg/g，结果表明，超声处理20 min与30 min含量变化不大，从节约能源考虑，规定超声处理20 min为提取时间。
本研究采用HPLC法对双黄连颗粒中绿原酸进行含量测定，试验结果表明，所建立的方法稳定、准确、可行，能有效控制双黄连颗粒的内在质量，确保临床疗效。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2005.406-408.
【关键词】 双黄连颗粒；绿原酸；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish the method for detemining the content of chlorogenic acid in Shuanghuanglian Keli by HPLC. Methods Using Diamonsil ODS1 C18 column， with methanol-water-glacial acetic acid （15∶85∶1） as the mobile phase， detection wavelength as 324 nm and flow rate was 1.0 mL/min. Results The calibration curve was linear at the range of 0.060～1.210 μg for chlorogenic acid and the equation was Y=105 427X+586.43， r2=0.999 5. The average recovery was 99.3% and RSD was 0.82% （n=6）. Conclusion This method was simple， accurate and proper， and the reduplication of the result was good， which provide scientific quantitative analysis method of chlorogenic acid in Shuanghuanglian Keli.
Key words：Shuanghuanglian Keli；chlorogenic acid；HPLC；content determination
双黄连颗粒收载于2005年版《中华人民共和国药典》（一部）[1]，处方由金银花、黄芩、连翘组成，功能疏风解表、清热解毒，用于外感风热所致的感冒。金银花为方中君药。原标准中只收载了黄芩的含量测定方法，没有君药金银花的成分含量测定方法，因此，不能有效和全面地控制药品质量。为了更好地控制双黄连颗粒的质量，提高双黄连颗粒的质量标准，我们参照2005年版《中华人民共和国药典》（一部）中收载的双黄连片，采用高效液相色谱（HPLC）法对金银花的主要成分绿原酸进行了含量测定，并进行了方法学研究。现报道如下。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：SPD-10A日本岛津；紫外分光仪：上海康化生化仪器制造厂；超声波清洗器：SK3200H上海科导超声仪器有限公司。
绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号110753-200413，供含量测定用）；双黄连颗粒由河南百年康鑫药业有限公司提供（批号20081101、20081102、20081103）。其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水-冰醋酸（15∶85∶1）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为324 nm。理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于6 000[1]。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含60 μL的溶液，即得对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约0.4 g，精密称定，置于50 mL的量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理（功率135 W，频率59 kHz）20 min。放置至室温，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.2.3 阴性样品的测试 取缺金银花的样品，按供试品制备方法制备阴性样品后测定，在绿原酸相应位置无峰出现，说明阴性样品的其他成分无干扰。色谱图见图1。图1双黄连颗粒HPLC图谱 注：A.对照品；B.供试品；C.阴性样品2.3 线性关系的考察
取同一对照品溶液（60.51 μg/mL），分别精密吸取1、2.5、5、10、20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，绿原酸对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=105 427X+586.43，r2=0.999 5，表明绿原酸在0.060～1.210 μg之间呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验
取同一对照品溶液，重复进样6次，每次进样10 μL，测定绿原酸峰面积，结果RSD=0.14%，表明精密度良好。
2.5 重复性试验
取同一批号（批号20081101）供试品，按供试品溶液制备方法制备5份供试液，依法测定每份样品中绿原酸的含量。结果RSD=1.18%，表明本法重复性良好。
2.6 稳定性试验
取同一批号（批号20081101）供试品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h测定峰面积，RSD=0.76%（n=5）。表明制备的供试品溶液在8 h内稳定。
2.7 加样回收率试验
采用加样回收法。精密称取已知含量的同一批样品（批号20081101，含量为5.217 mg/g）0.2 g，置50 mL量瓶中，分别精密加入绿原酸对照品溶液（0.375 mg/mL）各3 mL，蒸干，按“2.2.2”项下方法制备供试液，照上述色谱条件测定。分别进样10 μL，测定绿原酸峰面积并计算绿原酸含量（见表1） 表1加样回收率试验结果，结果平均回收率为99.3%，RSD=0.82%（n=6）。
2.8 样品测定
对3批中试产品进行测定，结果见表2。表2样品测定结果
3 讨论
根据3批测定结果，每1 g含金银花以绿原酸（C16H18O9）计均不少于5.0 mg，考虑到药材产地、加工、运输、贮藏等因素的影响，药材中绿原酸也会有较大的差别，因此暂规定本品每1 g含金银花以绿原酸（C16H18O9）计，不得少于4.5 mg。
为了保证供试品中绿原酸提取完全，本试验对供试品超声处理时间进行了考察，分别超声处理10、20、30 min进行测定，测得样品中对应的绿原酸含量分别为4.56、5.18、5.20 mg/g，结果表明，超声处理20 min与30 min含量变化不大，从节约能源考虑，规定超声处理20 min为提取时间。
本研究采用HPLC法对双黄连颗粒中绿原酸进行含量测定，试验结果表明，所建立的方法稳定、准确、可行，能有效控制双黄连颗粒的内在质量，确保临床疗效。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2005.406-408.