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摘要 为了检验内生菌荧光假单胞菌DLJ1和蜡状芽胞杆菌SZ5的促生与提高植株对南方根结线虫的防治效果，确定合适的菌剂接种方式，并分析其机制，本文以杀线剂阿维菌素为对照，比较了不同接菌方式下DLJ1 和SZ5对辣椒植株在南方根结线虫胁迫下的抗性以及对产量品质的影响。结果证实DLJ1在种子萌发期的一次接菌与萌发期与田间的5次接菌处理均可使根系根结数减少70%以上，使植株对南方根结线虫的抗性升至高抗级别，辣椒产量提高超过150%;DLJ1一次接菌处理组的果型最大、Vc与可溶性蛋白含量最高。SZ5萌发期一次处理根结数降低40%，植株对南方根结线虫表现为中抗，产量提高60%以上;SZ5多次接菌处理根结数只能降低27%，产量仅提高6%左右。阿维菌素处理的效果介于DLJ1和SZ5之间，可降低植株根结数45%，提高产量49%左右。分析其机理发现，两菌剂处理均可通过提高植株的POD酶活性和总酚含量，降低O-2产生速率和MDA积累，提高光合色素含量等来促进植物生长，通过提高几丁质酶活性来提高植株对线虫的抗性。总之，只需要在辣椒种子萌发期进行一次DLJ1接菌处理，即可使植株获得稳定而显著的促生和防治南方根結线虫双重效果，提示DLJ1菌在农业生产上的应用前景广阔。
关键词 植物内生菌; 辣椒; 南方根结线虫; 抗性; 产量; 品质
中图分类号： S 476
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019513
Abstract Two endophytes， DLJ1 （Pseudomonas fluorescens biovar I） and SZ5 （Bacillus cereus）， and a nematicide abamectin were used to compare their effects on the improvement of plant growth and plant resistance to Meloidogyne incognita， to determine the appropriate mode of inoculation， and to analyze its mechanism. The results showed that inoculation with DLJ1 once at germination stage or once at germination stage and 5 times in the field could decrease the number of root nodules by over 70%， improve the resistance of pepper plants to M.incognita to a high level， and increase the yield by over 150%. The fruit size was the biggest， and the contents of Vc and soluble proteins were the highest in the inoculation-with-DLJ1-once group. Inoculation with SZ5 once at germination stage reduced the number of root nodules only by 40%， improved the plant resistance to a medium level， and increased the yield by over 60%. Multiple inoculation with SZ5 decreased the number of root nodules only by 27% and increased the yield by 6%. The effect of abamectin treatment was between that of DLJ1 treatment and SZ5 treatment， which could reduce root nodules by about 45% and increase yield by about 49%. The results also showed that the growth-promoting effect of the two endophytes was possibly attributed to the increase of the POD activity and the total phenol content， the decrease of the O-2 production and MDA accumulation， and the enhancement of photosynthetic pigments contents in plants; the improved resistance of plants to nematodes was possibly attributed to the increase of chitinase activity in plants. In a word， inoculation of pepper plants with DLJ1 only once at the germination stage could achieve stable and significant effects of growth promoting and control of M.incognita. This suggests that DLJ1 has a broad application prospect in agricultural production. Key words endophyte; Capsicum annuum; Meloidogyne incognita; resistance; yield; quality
一年生茄科Solanaceae植物辣椒Capsicum annuum Linn.最常见、危害最大的土传病害是南方根结线虫Meloidogyne incognita Chitwood病[1]。虽然目前生产上有多种防治手段，但由于存在农业防治方法效率低、物理防治费用高、化学防治环境污染以及生物防治专一性强、稳定性差等原因，对该病害的防治效果一直不理想。
筛选潜在生防菌剂最常用的方法是从根际微生物中寻找对病原物有直接杀伤作用的菌株。但由于根际微生物受土壤环境影响巨大，作用不稳定，导致现在多数生防菌剂的应用受到一定限制。而内生菌由于定植于植物内部，作用稳定、环境友好，而且一系列研究还显示内生菌定殖后可以通过诱导植物防御反应来提高植株对逆境胁迫的抗性[2-3]。因此，筛选和利用合适的内生菌作为生防和促生菌剂是当前国际生物防治学和逆境生物学的热点内容[2-5]。
我們前期的工作显示，两株能够在辣椒体内定殖的内生菌荧光假单胞菌（生物型Ⅰ）Pseudomonas fluorescens （biovar Ⅰ）DLJ1[6]和蜡状芽胞杆菌Bacillus cereus SZ5[7]均可以产生1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate， 简称ACC）脱氨酶。虽然DLJ1在体外没有直接抑杀南方根结线虫的能力，但已有初步试验证实它比具有直接抑杀活性的SZ5更能促进辣椒生长，降低植株染病率，提高辣椒产量[8];并且萌发期的一次接菌处理，其生防效果可以维持终身。上述结果虽然提示萌发期一次接种DLJ1就可以在生产上发挥显著作用，但还有如下问题尚未确定：DLJ1和SZ5的生防效果是否稳定，如果在萌发期和移栽期同时接菌是否可以更好地发挥作用，与最常用的杀线剂阿维菌素相比，这两株内生菌的生防效果如何，以及两株菌的生防机制是什么。
鉴于此，本文继续以DLJ1和SZ5两株菌为试验材料，在萌发期、移栽期及田间，分别通过浸种、蘸根和土壤灌根等方式接种菌剂，并以阿维菌素为对照，确认DLJ1和SZ5提高辣椒植株对南方根结线虫的生防作用;探讨在萌发期、移栽期和田间的多次叠加接菌处理是否可以更好地抑制发病、提高辣椒产量和品质;并与阿维菌素的效果相比，分析植物内生菌DLJ1在农业生防上的可能应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料
辣椒C.annuum 种子，品种为‘韩育特大牛角椒’，购自江苏省农业科学院种子站。荧光假单胞菌（生物型Ⅰ）P.fluorescens （biovar Ⅰ）DLJ1（分离自辣椒果实）[6]和蜡状芽胞杆菌B.cereus SZ5（分离自成熟柿子）[7]由南京师范大学微生物工程研究中心筛选获得。南方根结线虫M.incognita MIJS3，由南京农业大学植保学院李红梅老师馈赠。泥炭育苗块（加拿大 Jiffy公司，直径3 cm）与全营养型速溶肥（花多多1号，美国 Scotts公司）均直接从市场购得。
1.2 处理方法
试验于2017年在南京师范大学植物园内进行。
1.2.1 菌悬液制备
参照刘维红等的方法[9]，将两菌株活化、培养、收集、洗涤、沉淀后，再用无菌水重悬沉淀至OD600值0.5±0.02，得到浓度相当于108 cfu/mL的菌悬液。
1.2.2 种子萌发与接菌、接线虫等处理
种子萌发与接菌：在3月13日按常规方法进行种子洗涤与30℃浸种12 h后，再置于事先用5 mL无菌水或菌悬液浸润的滤纸培养皿上、30℃ 16 h/20℃ 8 h黑暗中萌发。待种子萌发8 d后，在每组中选取长势一致的辣椒幼苗移栽到泥炭育苗块上，定期浇水，每周浇灌一次0.1%的全营养速溶肥，待长到4～6叶期将幼苗移栽到南京师范大学植物园中。
移栽与接菌：5月30日移栽时，根据萌发期的各种处理，取各处理组的一半植株进行相应的伤根浸菌5 min后，移栽到田间;移栽后，于6月19日、7月8日、7月29日和8月18日在移栽期接菌的各辣椒苗根部周围2～3 cm的土壤中均匀挖2个深3～5 cm的小孔，每孔灌入2.5 mL浓度为108 cfu/mL的相应菌悬液，共接种4次。
线虫获取：参照孟莎莎等的方法[10]分离番茄根部根结线虫卵块，26℃培养，孵化得2龄幼虫。参照彭双等的方法[11]分别在植物移栽后的7月2日和7月6日，每株每次接种2龄幼虫250条。
阿维菌素处理：分别在7月15日和7月29日，对部分未接菌的植株以1.8%阿维菌素乳油稀释1 000倍，每株灌根5 mL。
1.3 生理指标测定
在7月15日施加阿维菌素前和8月9日取正4位的叶片分别进行两次植物生理指标测定。
各光合色素含量测定和计算参照陈福明等的方法[12]。超氧阴离子（O-2）的测定参照刘彤彤等的方法[13]。POD活性测定采用愈创木酚法[14]。SOD活性的测定采用氮蓝四唑光化学还原法[15]，过氧化氢酶（CAT）活性的测定用Cakmak等的方法[16]。苯丙氨酸裂解酶活性测定按照刘太国等的方法[17]。多酚氧化酶活性测定参照朱宏波等的方法[18]。总黄酮含量测定参照王静的方法[19]。总酚含量测定参照滕冰等的方法[20]。β-1，3-葡聚糖酶液的提取参照史益敏[21]的方法，活性测定参照余永延等[22]的方法。几丁质酶测定参考杨海霞等[23]的方法，胶体几丁质的制备参考Nitoda等[24]的方法。脂氧合酶测定方法运用标准分光光度法[25]。
1.4 果实相关指标测定 分别在7月27日、8月15日和9月6日，每个处理组随机取10株植株，采摘果实并计算产量。并在8月15日对采摘的果实进行单果直径、果长以及单果重等的测量（n=10），并用紫外分光光度法测定果实Vc含量（以每100 g鲜果中含有Vc 的mg数计）[26]，用考马斯亮蓝法测定果实可溶性蛋白含量（以每g鲜果中含有可溶性蛋白的mg数计）[27]、用蒽酮比色法测定果实可溶性糖含量（以每100 g干果中含有可溶性糖的g数计）[28]。
1.5 病情指数与抗性指标测定
在试验末期（9月9日），每组随机拔取5株植株，将根系用流水冲洗净，调查根结比例并计算病情指数，确定抗性级别。
根结等级采用Garabedian等的分级标准[29]（表1）和白春明等的抗性指标[30]。
1.6 数据统计
试验结果以平均值表示，试验数据的处理和相关分析用Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 5和SPSS 18.0软件完成。图表中不同小写字母表示同一时期不同处理间有显著性差异（P
关键词 植物内生菌; 辣椒; 南方根结线虫; 抗性; 产量; 品质
中图分类号： S 476
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019513
Abstract Two endophytes， DLJ1 （Pseudomonas fluorescens biovar I） and SZ5 （Bacillus cereus）， and a nematicide abamectin were used to compare their effects on the improvement of plant growth and plant resistance to Meloidogyne incognita， to determine the appropriate mode of inoculation， and to analyze its mechanism. The results showed that inoculation with DLJ1 once at germination stage or once at germination stage and 5 times in the field could decrease the number of root nodules by over 70%， improve the resistance of pepper plants to M.incognita to a high level， and increase the yield by over 150%. The fruit size was the biggest， and the contents of Vc and soluble proteins were the highest in the inoculation-with-DLJ1-once group. Inoculation with SZ5 once at germination stage reduced the number of root nodules only by 40%， improved the plant resistance to a medium level， and increased the yield by over 60%. Multiple inoculation with SZ5 decreased the number of root nodules only by 27% and increased the yield by 6%. The effect of abamectin treatment was between that of DLJ1 treatment and SZ5 treatment， which could reduce root nodules by about 45% and increase yield by about 49%. The results also showed that the growth-promoting effect of the two endophytes was possibly attributed to the increase of the POD activity and the total phenol content， the decrease of the O-2 production and MDA accumulation， and the enhancement of photosynthetic pigments contents in plants; the improved resistance of plants to nematodes was possibly attributed to the increase of chitinase activity in plants. In a word， inoculation of pepper plants with DLJ1 only once at the germination stage could achieve stable and significant effects of growth promoting and control of M.incognita. This suggests that DLJ1 has a broad application prospect in agricultural production. Key words endophyte; Capsicum annuum; Meloidogyne incognita; resistance; yield; quality
一年生茄科Solanaceae植物辣椒Capsicum annuum Linn.最常见、危害最大的土传病害是南方根结线虫Meloidogyne incognita Chitwood病[1]。虽然目前生产上有多种防治手段，但由于存在农业防治方法效率低、物理防治费用高、化学防治环境污染以及生物防治专一性强、稳定性差等原因，对该病害的防治效果一直不理想。
筛选潜在生防菌剂最常用的方法是从根际微生物中寻找对病原物有直接杀伤作用的菌株。但由于根际微生物受土壤环境影响巨大，作用不稳定，导致现在多数生防菌剂的应用受到一定限制。而内生菌由于定植于植物内部，作用稳定、环境友好，而且一系列研究还显示内生菌定殖后可以通过诱导植物防御反应来提高植株对逆境胁迫的抗性[2-3]。因此，筛选和利用合适的内生菌作为生防和促生菌剂是当前国际生物防治学和逆境生物学的热点内容[2-5]。
我們前期的工作显示，两株能够在辣椒体内定殖的内生菌荧光假单胞菌（生物型Ⅰ）Pseudomonas fluorescens （biovar Ⅰ）DLJ1[6]和蜡状芽胞杆菌Bacillus cereus SZ5[7]均可以产生1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate， 简称ACC）脱氨酶。虽然DLJ1在体外没有直接抑杀南方根结线虫的能力，但已有初步试验证实它比具有直接抑杀活性的SZ5更能促进辣椒生长，降低植株染病率，提高辣椒产量[8];并且萌发期的一次接菌处理，其生防效果可以维持终身。上述结果虽然提示萌发期一次接种DLJ1就可以在生产上发挥显著作用，但还有如下问题尚未确定：DLJ1和SZ5的生防效果是否稳定，如果在萌发期和移栽期同时接菌是否可以更好地发挥作用，与最常用的杀线剂阿维菌素相比，这两株内生菌的生防效果如何，以及两株菌的生防机制是什么。
鉴于此，本文继续以DLJ1和SZ5两株菌为试验材料，在萌发期、移栽期及田间，分别通过浸种、蘸根和土壤灌根等方式接种菌剂，并以阿维菌素为对照，确认DLJ1和SZ5提高辣椒植株对南方根结线虫的生防作用;探讨在萌发期、移栽期和田间的多次叠加接菌处理是否可以更好地抑制发病、提高辣椒产量和品质;并与阿维菌素的效果相比，分析植物内生菌DLJ1在农业生防上的可能应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料
辣椒C.annuum 种子，品种为‘韩育特大牛角椒’，购自江苏省农业科学院种子站。荧光假单胞菌（生物型Ⅰ）P.fluorescens （biovar Ⅰ）DLJ1（分离自辣椒果实）[6]和蜡状芽胞杆菌B.cereus SZ5（分离自成熟柿子）[7]由南京师范大学微生物工程研究中心筛选获得。南方根结线虫M.incognita MIJS3，由南京农业大学植保学院李红梅老师馈赠。泥炭育苗块（加拿大 Jiffy公司，直径3 cm）与全营养型速溶肥（花多多1号，美国 Scotts公司）均直接从市场购得。
1.2 处理方法
试验于2017年在南京师范大学植物园内进行。
1.2.1 菌悬液制备
参照刘维红等的方法[9]，将两菌株活化、培养、收集、洗涤、沉淀后，再用无菌水重悬沉淀至OD600值0.5±0.02，得到浓度相当于108 cfu/mL的菌悬液。
1.2.2 种子萌发与接菌、接线虫等处理
种子萌发与接菌：在3月13日按常规方法进行种子洗涤与30℃浸种12 h后，再置于事先用5 mL无菌水或菌悬液浸润的滤纸培养皿上、30℃ 16 h/20℃ 8 h黑暗中萌发。待种子萌发8 d后，在每组中选取长势一致的辣椒幼苗移栽到泥炭育苗块上，定期浇水，每周浇灌一次0.1%的全营养速溶肥，待长到4～6叶期将幼苗移栽到南京师范大学植物园中。
移栽与接菌：5月30日移栽时，根据萌发期的各种处理，取各处理组的一半植株进行相应的伤根浸菌5 min后，移栽到田间;移栽后，于6月19日、7月8日、7月29日和8月18日在移栽期接菌的各辣椒苗根部周围2～3 cm的土壤中均匀挖2个深3～5 cm的小孔，每孔灌入2.5 mL浓度为108 cfu/mL的相应菌悬液，共接种4次。
线虫获取：参照孟莎莎等的方法[10]分离番茄根部根结线虫卵块，26℃培养，孵化得2龄幼虫。参照彭双等的方法[11]分别在植物移栽后的7月2日和7月6日，每株每次接种2龄幼虫250条。
阿维菌素处理：分别在7月15日和7月29日，对部分未接菌的植株以1.8%阿维菌素乳油稀释1 000倍，每株灌根5 mL。
1.3 生理指标测定
在7月15日施加阿维菌素前和8月9日取正4位的叶片分别进行两次植物生理指标测定。
各光合色素含量测定和计算参照陈福明等的方法[12]。超氧阴离子（O-2）的测定参照刘彤彤等的方法[13]。POD活性测定采用愈创木酚法[14]。SOD活性的测定采用氮蓝四唑光化学还原法[15]，过氧化氢酶（CAT）活性的测定用Cakmak等的方法[16]。苯丙氨酸裂解酶活性测定按照刘太国等的方法[17]。多酚氧化酶活性测定参照朱宏波等的方法[18]。总黄酮含量测定参照王静的方法[19]。总酚含量测定参照滕冰等的方法[20]。β-1，3-葡聚糖酶液的提取参照史益敏[21]的方法，活性测定参照余永延等[22]的方法。几丁质酶测定参考杨海霞等[23]的方法，胶体几丁质的制备参考Nitoda等[24]的方法。脂氧合酶测定方法运用标准分光光度法[25]。
1.4 果实相关指标测定 分别在7月27日、8月15日和9月6日，每个处理组随机取10株植株，采摘果实并计算产量。并在8月15日对采摘的果实进行单果直径、果长以及单果重等的测量（n=10），并用紫外分光光度法测定果实Vc含量（以每100 g鲜果中含有Vc 的mg数计）[26]，用考马斯亮蓝法测定果实可溶性蛋白含量（以每g鲜果中含有可溶性蛋白的mg数计）[27]、用蒽酮比色法测定果实可溶性糖含量（以每100 g干果中含有可溶性糖的g数计）[28]。
1.5 病情指数与抗性指标测定
在试验末期（9月9日），每组随机拔取5株植株，将根系用流水冲洗净，调查根结比例并计算病情指数，确定抗性级别。
根结等级采用Garabedian等的分级标准[29]（表1）和白春明等的抗性指标[30]。
1.6 数据统计
试验结果以平均值表示，试验数据的处理和相关分析用Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 5和SPSS 18.0软件完成。图表中不同小写字母表示同一时期不同处理间有显著性差异（P