论文部分内容阅读
摘要 RNAi能够抑制基因特异序列的表达，为昆虫学研究提供了新方法，尤其是可以分析基因的功能，控制害虫种群以及减少疾病病原体的感染。不同种群、RNAi摄入方式、靶标基因都会影响RNAi的效率，是转录本抑制程度存在差异的原因所在。对于不能稳定转基因的物种，如昆虫，利用dsRNA介导的 RNAi技术便成为快速分析基因功能的重要手段。介绍了RNAi技术的作用机制，并从控制害虫和保护益虫方面总结了RNAi技术的应用。
关键词 RNAi；害虫控制；dsRNA；机制；应用
中图分类号 S433；Q789 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07-0144-02
RNA干扰已经彻底改变了昆虫学的研究范围，使研究者能够通过抑制目的基因的表达，将改变的表型和基因功能联系起来。对于基础研究而言，RNAi（又称基因沉默）为所有的昆虫基因组学研究提供了一条路径，同时对应用昆虫学也有巨大的潜在作用。例如，RNAi能够通过抑制关键基因提高死亡率控制害虫。此外，利用无害的病毒序列启动抗病毒RNAi反应，能够有效防止益虫（如蜜蜂和家蚕） 感染高致病性病毒。
1 RNAi的机制
RNAi是利用非编码小RNA分子切割靶标mRNA抑制基因表达。主要分为以下3个阶段。
1.1 起始阶段
核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以 ATP 依赖的方式逐步切割加工导入生物体的外源或内源性转录生成的dsRNA，生成21～23nt的siRNA（small interfering RNA），其与靶标mRNA具有高度特异性，为成功降解提供保证。
1.2 效应阶段
siRNA 双链结合其他蛋白复合物形成RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex RISC），双链siRNA解链，RISC介导单链反义siRNA通过碱基配对原则从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，进一步降解mRNA，同时还可以引发宿主细胞的一系列反应。
1.3 放大效应阶段
siRNA在引导RISC切割靶RNA的同时，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA为模板合成新的dsRNA。紧接着进入第一步循环过程，生成大量次级siRNA，经过逐级放大效应，使mRNA彻底降解。
2 RNAi技术的应用
利用RNAi技术控制害虫和保护驯化益虫（例如蜜蜂）已经得到广泛应用。一般情况下，RNAi序列适用于任何形式，从单个基因型到家系，甚至昆虫所属的目；因为目标序列可以随意操控。
2.1 利用RNAi控制害虫
利用RNAi控制害虫最早是应用于玉米根虫和棉铃虫。研究者喂养玉米根虫含有290条dsRNAs的人工饲料，发现14个基因会使成虫的生理活动下降，并且对液泡ATP酶亚基A基因（V-ATPase）进行了详细的分析。人工饲料中只含有低浓度V-ATPase的dsRNAs，经玉米根虫取食后，相应的mRNA受到抑制。更重要的是，研究者将玉米根虫喂养在表达V-ATPase dsRNAs的转基因玉米上后，发现根虫的V-ATPase基因表达量下降，玉米根部受损程度降低[1]。研究者发现棉铃虫有1个靶标基因细胞色素P450（CYP6AE1），该基因在幼虫中肠中表达，对棉花的二级次生代谢产物棉子酚具有解毒功能[2]。当将棉铃虫喂养在表达CYP6AE14 dsR-NA的转基因拟南芥和烟草上时，该基因在虫体中肠里的表达量下降，幼虫生长发育减速[3]。同时在玉米根虫和棉铃虫上也都有了新发现[4]。其中Snf7基因主要参与膜受体的运输，在玉米根虫中的效果非常显著。同时在棉花中表达半胱氨酸蛋白酶，棉铃虫取食后，虫体围食膜功能减弱，变得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同时表达dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比单一表达其中一个基因的抗性强[5]。
上述研究阐明利用RNAi控制害虫有2个关键因素：①用于RNAi靶标基因序列的选择；②传递dsRNA的方式。其中靶标基因必须是昆虫的关键基因，同时在昆虫的整个生活史中要持续表达。随着技术从理论证明到应用的转变，严苛设计靶标序列是必须的。先决条件就是从dsRNA中获得的21～25 bp siRNAs必须与序列保证完全的一致性，同时与昆虫的mRNA具有同源性，与非靶标物种的所有siRNAs和编码蛋白基因具有序列差异性。在网上将候选dsRNA同时与靶标物种的目的基因及所有公共基因组中预测的编码蛋白的基因进行比对，杜绝不能与靶标序列完全匹配以及与非靶标物种序列匹配的siRNAs。
RNAi成功的第2个关键就是在有效剂量下传递放大RNAi信号。目前dsRNA合成方法已有重大突破，一次能够合成1 kg左右，合成成本的持续下降将有利于dsRNA产品应用于鱼饵、生物农药喷雾以及灌溉系统中。利用植物介导的RNAi已经广泛应用于控制咀嚼式昆虫（例如玉米根虫和棉铃虫）和刺吸式昆虫。Bt抗虫转基因作物控制刺吸式昆虫的作用甚微，因为Bt类毒素尚未对这些昆虫产生作用。由于生态释放导致广谱杀蟲剂的使用逐渐减少，Bt作物上的害虫却逐年增加。因此，利用植物介导的RNAi解决了这个难题，在褐飞虱和蚜虫中都得到了应用。此方法可以代替传统杀虫剂，例如可以作为城市害虫（蚂蚁、蟑螂、白蚁）的杀虫饵剂；其商业潜力主要取决于dsRNA传递给靶标昆虫的效率、dsRNA是否在昆虫体内能稳定存在、作为杀虫饵剂的浓度。上述因素均影响dsRNA的生产成本。因此，加强昆虫细胞吸收dsRNA和保证dsRNA在昆虫体内不被dsRNases降解至关重要。
2.2 利用RNAi保护益虫
许多真核寄生虫对RNAi敏感，可以利用这一特点增强益虫的健康。当然，这个策略不适用于细菌性病原体或某些真核生物（如锥和疟原虫物种），因为其缺乏RNAi的能力。最经典的例子就是蜜蜂的寄生虫疾病，此疾病会导致蜜蜂高发病率和高死亡率。蜜蜂的寄生虫具备应用RNAi的2个要点：首先，其具有RNAi的分子机制；其次，中肠作为摄取dsRNA的场所，寄生虫能够在蜜蜂中肠上繁殖。蜜蜂寄生虫的ADP/ATP转运子对于能量代谢是至关重要的，当感染疾病的蜜蜂取食了含有寄生虫的ADP/ATP转运子的dsRNA后，寄生虫的靶标基因表达量下降，蜜蜂的死亡率会随之下降。 真核寄生蟲除了能够利用肠道作为传递RANi的场所，还可以利用昆虫器官传递系统性RNAi信号，已经在以蜜蜂血液为食的寄生虫瓦螨中得到证实。当蜜蜂取食了瓦螨特定基因的dsRNA之后，寄居在蜜蜂上的螨虫群体明显减少，同时对蜜蜂没有明显的有害影响。随后，研究者利用荧光蛋白的dsRNA（dsRNA-GFP）检测蜜蜂体内是否能够进行系统性RNAi。蜜蜂和寄生虫体内均没有绿色荧光蛋白基因，故可以利用GFP-RNA检测干扰效果。当感染寄生虫的蜜蜂取食含有dsRNA-GFP的蔗糖溶液后，寄生虫全身覆盖GFP-RNA。除此而外，将这些寄生虫转移到没有取食dsR-NA-GFP的蜜蜂上，蜜蜂体内会含有GFP-RNA。说明RNAi信号不仅可以在昆虫个体水平进行传播和放大，同时还可以在蜜蜂繁殖群体水平进行传播。下一步需要研究如何使RNAi的效率和剂量持续保护益虫群体，同时控制寄生虫的成本是否合理，以及对蜜蜂群体的健康是否有害都需要加以考虑。
可以利用RNAi抗病毒保护昆虫，同时也可以利用RNAi进行抗病毒治疗。利用RNAi介导来抑制昆虫感染病毒，同时还可以预防一些人类、牲畜和农作物严重病毒性疾病。外源提供和摄取的dsRNA可以提高宿主本身RNAi运转效率，保护宿主包括预防和直接治疗。RNAi介导的抗病毒免疫有利于抑制蚊子的登革热病毒、辛德毕斯病毒和西尼罗河病毒等。此外，加强RNAi通路能够促进病毒抑制，例如通过基因工程使昆虫体内表达特定病毒序列的反向重复RNA，从而促发dsRNA生成。
蜜蜂是另一个遭病毒侵袭亟须被保护的昆虫，其中以色列急性麻痹病毒（IAPV）可能导致蜜蜂种群持续下降和群落消失的危险。科学家通过体外合成IAPV基因组的dsRNA，感染IAPV的蜜蜂取食后，体内的RNAi工厂机制可以消除IAPV。实验室和蜂场试验表明，在接种IAPV以前饲喂特异RNA的IAPV，与只接种IAPV比较，其幼虫孵化率和产蜜量均明显较高。此结果在美国已经进行了大量的田间试验。2007年Beeologics公司成立了一个研究小组，开始研制一种治疗此病毒的制剂，研发出杀死IAPV的药物Remebee，是利用核糖核酸干扰机制，阻止目的基因表达。Remebee是以RANi为基础，理论上RANi生物制剂能促使RANi发生。
3 展望
近年对昆虫RNAi的研究展示了科学发现的伟大力量和其控制昆虫种群的潜力。随着科学技术的不断发展，RNAi已经不再是灵丹妙药，但却提出了一系列的新概念，给昆虫学家提出了新的技术挑战，没有一种技术是适用于所有物种的。同时，RNAi信号是如何在单个细胞里放大和在昆虫细胞间传播的也始终困扰着科学家。因此，昆虫RNAi如何运转的问题仍需坚持不懈的研究探索。
4 参考文献
[1] BAUM JA，BOGAERT T FAU-CLINTON W，CLINTON W FAU-HECK GR，et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].Nat biotechnol，2007（11）：1322-1326.
[2] MAO YB，CAI WJ，WANG JW，et al.ilencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol[J].Nat Biotechnol，2007（25）：1307-1313.
[3] MAO YB，TAO XY，XUE XY，et al.Cotton plants expressing CYP6AE14 double-stranded RNA show enhanced resistance to bollworms[J].Transg-enic Res，2011，20：665-673.
[4] BOLOGNESI R，RAMASESHADRI P，ANDERSON J，et al.Character-izing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm （Diabrotica virgifera virgifera LeConte）[J].PLoS One，2012，7：e47534.
[5] MAO YB，XUE XY，TAO XY，et al.Cysteine protease enhances plant-m-ediated bollworm RNA interference[J].Plant Mol Biol，2013，83：119-129.
关键词 RNAi；害虫控制；dsRNA；机制；应用
中图分类号 S433；Q789 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07-0144-02
RNA干扰已经彻底改变了昆虫学的研究范围，使研究者能够通过抑制目的基因的表达，将改变的表型和基因功能联系起来。对于基础研究而言，RNAi（又称基因沉默）为所有的昆虫基因组学研究提供了一条路径，同时对应用昆虫学也有巨大的潜在作用。例如，RNAi能够通过抑制关键基因提高死亡率控制害虫。此外，利用无害的病毒序列启动抗病毒RNAi反应，能够有效防止益虫（如蜜蜂和家蚕） 感染高致病性病毒。
1 RNAi的机制
RNAi是利用非编码小RNA分子切割靶标mRNA抑制基因表达。主要分为以下3个阶段。
1.1 起始阶段
核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以 ATP 依赖的方式逐步切割加工导入生物体的外源或内源性转录生成的dsRNA，生成21～23nt的siRNA（small interfering RNA），其与靶标mRNA具有高度特异性，为成功降解提供保证。
1.2 效应阶段
siRNA 双链结合其他蛋白复合物形成RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex RISC），双链siRNA解链，RISC介导单链反义siRNA通过碱基配对原则从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，进一步降解mRNA，同时还可以引发宿主细胞的一系列反应。
1.3 放大效应阶段
siRNA在引导RISC切割靶RNA的同时，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA为模板合成新的dsRNA。紧接着进入第一步循环过程，生成大量次级siRNA，经过逐级放大效应，使mRNA彻底降解。
2 RNAi技术的应用
利用RNAi技术控制害虫和保护驯化益虫（例如蜜蜂）已经得到广泛应用。一般情况下，RNAi序列适用于任何形式，从单个基因型到家系，甚至昆虫所属的目；因为目标序列可以随意操控。
2.1 利用RNAi控制害虫
利用RNAi控制害虫最早是应用于玉米根虫和棉铃虫。研究者喂养玉米根虫含有290条dsRNAs的人工饲料，发现14个基因会使成虫的生理活动下降，并且对液泡ATP酶亚基A基因（V-ATPase）进行了详细的分析。人工饲料中只含有低浓度V-ATPase的dsRNAs，经玉米根虫取食后，相应的mRNA受到抑制。更重要的是，研究者将玉米根虫喂养在表达V-ATPase dsRNAs的转基因玉米上后，发现根虫的V-ATPase基因表达量下降，玉米根部受损程度降低[1]。研究者发现棉铃虫有1个靶标基因细胞色素P450（CYP6AE1），该基因在幼虫中肠中表达，对棉花的二级次生代谢产物棉子酚具有解毒功能[2]。当将棉铃虫喂养在表达CYP6AE14 dsR-NA的转基因拟南芥和烟草上时，该基因在虫体中肠里的表达量下降，幼虫生长发育减速[3]。同时在玉米根虫和棉铃虫上也都有了新发现[4]。其中Snf7基因主要参与膜受体的运输，在玉米根虫中的效果非常显著。同时在棉花中表达半胱氨酸蛋白酶，棉铃虫取食后，虫体围食膜功能减弱，变得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同时表达dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比单一表达其中一个基因的抗性强[5]。
上述研究阐明利用RNAi控制害虫有2个关键因素：①用于RNAi靶标基因序列的选择；②传递dsRNA的方式。其中靶标基因必须是昆虫的关键基因，同时在昆虫的整个生活史中要持续表达。随着技术从理论证明到应用的转变，严苛设计靶标序列是必须的。先决条件就是从dsRNA中获得的21～25 bp siRNAs必须与序列保证完全的一致性，同时与昆虫的mRNA具有同源性，与非靶标物种的所有siRNAs和编码蛋白基因具有序列差异性。在网上将候选dsRNA同时与靶标物种的目的基因及所有公共基因组中预测的编码蛋白的基因进行比对，杜绝不能与靶标序列完全匹配以及与非靶标物种序列匹配的siRNAs。
RNAi成功的第2个关键就是在有效剂量下传递放大RNAi信号。目前dsRNA合成方法已有重大突破，一次能够合成1 kg左右，合成成本的持续下降将有利于dsRNA产品应用于鱼饵、生物农药喷雾以及灌溉系统中。利用植物介导的RNAi已经广泛应用于控制咀嚼式昆虫（例如玉米根虫和棉铃虫）和刺吸式昆虫。Bt抗虫转基因作物控制刺吸式昆虫的作用甚微，因为Bt类毒素尚未对这些昆虫产生作用。由于生态释放导致广谱杀蟲剂的使用逐渐减少，Bt作物上的害虫却逐年增加。因此，利用植物介导的RNAi解决了这个难题，在褐飞虱和蚜虫中都得到了应用。此方法可以代替传统杀虫剂，例如可以作为城市害虫（蚂蚁、蟑螂、白蚁）的杀虫饵剂；其商业潜力主要取决于dsRNA传递给靶标昆虫的效率、dsRNA是否在昆虫体内能稳定存在、作为杀虫饵剂的浓度。上述因素均影响dsRNA的生产成本。因此，加强昆虫细胞吸收dsRNA和保证dsRNA在昆虫体内不被dsRNases降解至关重要。
2.2 利用RNAi保护益虫
许多真核寄生虫对RNAi敏感，可以利用这一特点增强益虫的健康。当然，这个策略不适用于细菌性病原体或某些真核生物（如锥和疟原虫物种），因为其缺乏RNAi的能力。最经典的例子就是蜜蜂的寄生虫疾病，此疾病会导致蜜蜂高发病率和高死亡率。蜜蜂的寄生虫具备应用RNAi的2个要点：首先，其具有RNAi的分子机制；其次，中肠作为摄取dsRNA的场所，寄生虫能够在蜜蜂中肠上繁殖。蜜蜂寄生虫的ADP/ATP转运子对于能量代谢是至关重要的，当感染疾病的蜜蜂取食了含有寄生虫的ADP/ATP转运子的dsRNA后，寄生虫的靶标基因表达量下降，蜜蜂的死亡率会随之下降。 真核寄生蟲除了能够利用肠道作为传递RANi的场所，还可以利用昆虫器官传递系统性RNAi信号，已经在以蜜蜂血液为食的寄生虫瓦螨中得到证实。当蜜蜂取食了瓦螨特定基因的dsRNA之后，寄居在蜜蜂上的螨虫群体明显减少，同时对蜜蜂没有明显的有害影响。随后，研究者利用荧光蛋白的dsRNA（dsRNA-GFP）检测蜜蜂体内是否能够进行系统性RNAi。蜜蜂和寄生虫体内均没有绿色荧光蛋白基因，故可以利用GFP-RNA检测干扰效果。当感染寄生虫的蜜蜂取食含有dsRNA-GFP的蔗糖溶液后，寄生虫全身覆盖GFP-RNA。除此而外，将这些寄生虫转移到没有取食dsR-NA-GFP的蜜蜂上，蜜蜂体内会含有GFP-RNA。说明RNAi信号不仅可以在昆虫个体水平进行传播和放大，同时还可以在蜜蜂繁殖群体水平进行传播。下一步需要研究如何使RNAi的效率和剂量持续保护益虫群体，同时控制寄生虫的成本是否合理，以及对蜜蜂群体的健康是否有害都需要加以考虑。
可以利用RNAi抗病毒保护昆虫，同时也可以利用RNAi进行抗病毒治疗。利用RNAi介导来抑制昆虫感染病毒，同时还可以预防一些人类、牲畜和农作物严重病毒性疾病。外源提供和摄取的dsRNA可以提高宿主本身RNAi运转效率，保护宿主包括预防和直接治疗。RNAi介导的抗病毒免疫有利于抑制蚊子的登革热病毒、辛德毕斯病毒和西尼罗河病毒等。此外，加强RNAi通路能够促进病毒抑制，例如通过基因工程使昆虫体内表达特定病毒序列的反向重复RNA，从而促发dsRNA生成。
蜜蜂是另一个遭病毒侵袭亟须被保护的昆虫，其中以色列急性麻痹病毒（IAPV）可能导致蜜蜂种群持续下降和群落消失的危险。科学家通过体外合成IAPV基因组的dsRNA，感染IAPV的蜜蜂取食后，体内的RNAi工厂机制可以消除IAPV。实验室和蜂场试验表明，在接种IAPV以前饲喂特异RNA的IAPV，与只接种IAPV比较，其幼虫孵化率和产蜜量均明显较高。此结果在美国已经进行了大量的田间试验。2007年Beeologics公司成立了一个研究小组，开始研制一种治疗此病毒的制剂，研发出杀死IAPV的药物Remebee，是利用核糖核酸干扰机制，阻止目的基因表达。Remebee是以RANi为基础，理论上RANi生物制剂能促使RANi发生。
3 展望
近年对昆虫RNAi的研究展示了科学发现的伟大力量和其控制昆虫种群的潜力。随着科学技术的不断发展，RNAi已经不再是灵丹妙药，但却提出了一系列的新概念，给昆虫学家提出了新的技术挑战，没有一种技术是适用于所有物种的。同时，RNAi信号是如何在单个细胞里放大和在昆虫细胞间传播的也始终困扰着科学家。因此，昆虫RNAi如何运转的问题仍需坚持不懈的研究探索。
4 参考文献
[1] BAUM JA，BOGAERT T FAU-CLINTON W，CLINTON W FAU-HECK GR，et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].Nat biotechnol，2007（11）：1322-1326.
[2] MAO YB，CAI WJ，WANG JW，et al.ilencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol[J].Nat Biotechnol，2007（25）：1307-1313.
[3] MAO YB，TAO XY，XUE XY，et al.Cotton plants expressing CYP6AE14 double-stranded RNA show enhanced resistance to bollworms[J].Transg-enic Res，2011，20：665-673.
[4] BOLOGNESI R，RAMASESHADRI P，ANDERSON J，et al.Character-izing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm （Diabrotica virgifera virgifera LeConte）[J].PLoS One，2012，7：e47534.
[5] MAO YB，XUE XY，TAO XY，et al.Cysteine protease enhances plant-m-ediated bollworm RNA interference[J].Plant Mol Biol，2013，83：119-129.