论文部分内容阅读
摘要 苹果基因组研究的不断深入，为苹果属植物蛋白质组学研究奠定了基础。近年来，蛋白质组学分析方法在探讨苹果属植物应答病原菌胁迫时，所启动的抗病相关蛋白的差异表达，以及相关抗病机制方面发挥了重要作用。本文针对近年来蛋白质组学研究技术在果树上的应用，综述了苹果属植物应答火疫病、褐斑病、黑星病等主要病害胁迫的蛋白质组学研究进展，分析了蛋白质组学分析技术在苹果属植物相关研究中存在的问题，以期为进一步探究苹果属植物抗病的分子机制提供参考。
关键词 苹果； 病原菌； 蛋白质组学； 研究进展
中图分类号： S 432.2
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2015.06.003
Abstract Rapid development of apple genome research builds up an important basis for proteomics research of Malus spp. In recent years， proteomics approaches played a key role in exploring the differential expression of defenserelated proteins induced by the pathogens， and understanding the molecular mechanism of apple host resistance to the pathogens. Based on the application of proteomics approaches on fruit trees， we review the apple proteomics studies， including the resistancerelated proteins of apple host induced by some main diseases in apple production， such as fire blight， Marssonina apple blotch， and apple scab， which will provide some clues to a comprehensive understanding of the molecular mechanism of apple host resistance to the pathogens.
Key words apple； pathogen； proteomics； progress
以往关于模式植物抗病分子机制研究表明，植物寄主应答病原菌胁迫时，寄主细胞自身免疫受体（抗病蛋白）能够识别病原菌效应因子，进而诱发寄主细胞自身抗病反应，实现对病原菌胁迫信号的响应、传递以及生物学防御[13]。
目前，国内外苹果产业已进入快速发展期，然而，迄今为止，各种病害的发生仍然是制约苹果产业发展的瓶颈，由此，各国育种部门逐渐关注以提高果树自身抗性为目标的抗性育种研究[45]。由于苹果属多年生木本植物，童期较长、且遗传背景高度杂合，常规的育种手段很难在短期内培育出高抗优质的新种质。分子生物学技术的不断发展和完善，为系统了解苹果属植物响应病原菌胁迫的防御反应过程提供了技术参考。近年不断发展的基因组学、蛋白质组学研究，使得挖掘抗病相关功能基因或蛋白，并利用基因工程手段加快苹果抗病种质的遗传改良研究成为现实。开展植物寄主与病原菌互作的差异蛋白质组学研究，将有助于从分子水平上了解植物寄主应答病原菌胁迫的抗病机制。本文就近年来国内外关于苹果属植物应答病原真菌胁迫的蛋白质组学研究作一概述，以期为进一步应用蛋白质组学方法探究苹果属植物抗病的分子机制提供参考。
1 植物寄主应答病原菌胁迫的抗病机制
病原菌是导致植物寄主发病的生物胁迫因子。在自然条件下，植物寄主与病原菌互作涉及复杂的防御反应过程，包括细胞壁增厚、各种抗病相关蛋白的诱导表达及毒素的分泌等[1，67]。此外，植物寄主应答病原菌侵染的抗病或感病反应与其自身的免疫系统相关，包括寄主与病原菌间的相互识别、相互竞争[1]。
通过对胡椒、烟草等植物的抗病分子机制研究发现，植物寄主应答病原菌胁迫时，常通过寄主细胞内某些抗性相关蛋白的特异性表达，影响或抵御病原菌的进一步侵染[3，8]。
抗病反应涉及多种抗性相关蛋白的表达，如病程相关蛋白（pathogenesis related protein，PR）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、热激蛋白（Hsp）、氧化胁迫反应相关蛋白以及其他次生代谢蛋白等（图1）[1，10]。
其中，PR类蛋白是植物寄主在抗病反应过程中产生的一类具有广谱抗性的可溶性蛋白[1，910]，目前，关于其基因表达调控的分子机制研究取得了很大进展[3，8]。根据PR蛋白的植物来源、氨基酸序列同源性以及生化功能等，可将PR蛋白分为17类[11]，包括：富含甘氨酸的PR蛋白（PR1）、β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanases） （PR2）、几丁质酶（chitinase） （PR3）、类甜蛋白（thaumatinlike protein）（PR5）、过氧化物酶类（peroxidases）（PR9）、过敏反应相关的PR蛋白（PR10）等。研究表明，其中的PR2、PR3、PR5以及PR9等PR类蛋白能有效抑制病原菌的生长和扩散，已被鉴定为具有潜在抗真菌活性的抗病蛋白[1，3， 810]。
研究表明，寄主细胞内PR类蛋白的特异性表达对病原菌致病能力的发挥具有重要影响。目前，植物寄主响应病原真菌胁迫的蛋白质组学研究在拟南芥、水稻、玉米、番茄等模式植物中已得到广泛开展，大量的抗病相关蛋白已被成功鉴定[1215]。 2 蛋白质组学研究技术在果树研究中的应用
近年来，随着功能基因组学研究方法的不断发展，蛋白质组学（proteomics）技术作为功能基因组学研究的重要支柱，已成为分子生物学领域的前沿学科，其技术的日趋成熟与完善，已能实现在蛋白质水平上以高通量方式直接研究基因功能[10， 16]。
相较于稳定的基因组信息，蛋白质组具备其动态变化的特殊性，如结构的形成、修饰、定位、相互作用等，这些信息均无法直接从基因组信息中获得。因此，若要精确地研究基因的功能，解释复杂的生命现象，就必然要在定量、整体、动态的水平上对基因表达产物（蛋白质）进行研究，即进行蛋白质组学的研究[17]。蛋白质组学研究的不断发展，也为苹果属植物相关研究创造了良好的技术体系。
近几年，随着果树基因组研究工作的不断深入和完善，蛋白质组学分析技术已经应用于梨[18]、桃[19]、香蕉[20]等多年生果树品种研究上，关于苹果属植物材料蛋白质组学方面的研究也已陆续开展[2125]。2010年公布了 ‘金冠’（Golden delicious）苹果的全基因组草图[26]，其测序结果所产生的海量数据，为苹果属植物蛋白质组学、基因组学等相关研究的开展奠定了重要基础。
苹果果皮较薄，采摘前后很容易受到机械损伤，而形成的伤口又为其他病原菌的侵染制造了机会。BuronMoles 等[27]以‘金冠’苹果为研究对象，分析了机械伤害处理前后，果实总蛋白的差异表达情况。研究发现，果实经机械伤害处理48 h后，其差异表达蛋白主要为胁迫反应相关蛋白，包括β1，3葡聚糖酶等病程相关的PR类蛋白，该研究为充分认识苹果属植物应答机械损伤胁迫的抗性机制提供参考。
3 苹果属植物应答病原菌胁迫的蛋白质组学研究
目前，利用成熟的蛋白质组学分析技术，在苹果属植物寄主应答病原菌研究中，已筛选获得大量由病原菌诱导产生，来源于寄主的功能蛋白。此外，还明确了各类蛋白，尤其是病程相关PR类蛋白，在苹果属植物防御反应机制中的具体作用，为开展相关的基因组学和转录组学研究提供了重要参考。
由欧文氏细菌（Erwinia amylovora） 侵染而引发的火疫病（fire blight），是苹果及其他蔷薇科植物的毁灭性病害，已成为影响苹果、梨产业发展的重要病害之一[28]。目前，关于苹果属植物寄主与火疫病致病菌互作方面的研究，主要集中于病原菌致病机理，尤其是互作过程中效应蛋白（effector proteins）的分泌及其转运途径研究[2930]，研究发现，苹果属植物寄主应答火疫病菌侵染，主要依赖于自身抗性基因与致病菌效应因子的亲和性或非亲和性互作，包括病原菌致病相关的两类效应蛋白（DspE和HrpN）与苹果寄主细胞抗病基因的互作，进而产生抗病或感病反应[31]。苹果褐腐病（brown rot）是由链核盘菌（Monilinia laxa）侵染苹果花、幼苗及嫩枝引起的真菌性病害，主要表现为果实成熟期落果，或采后贮存期腐烂[32]。为了探讨褐腐病病菌对仁果类、核果类寄主的专一性，Bregar 等[33]利用差异蛋白质组学方法，以从苹果、杏发病果实上分离纯化的褐腐病菌为研究试材，比较了两种寄主分离菌的总蛋白表达谱。通过对软件分析获得的50个差异蛋白点进行质谱检测，共有41个蛋白点被成功鉴定，依据功能信息可划分为蛋白质代谢、能量产生、糖代谢、胁迫反应、脂肪酸代谢及其他蛋白等6类。通过比较分析发现，某些已经研究证实的毒性因子蛋白仅在苹果分离菌株中有表达，然而，关于这些蛋白的寄主专一性机制仍不清楚。该研究共获得10个仅在苹果分离菌中特异表达的差异蛋白，其中乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）上调量达11倍，表明该蛋白有可能作为苹果褐腐病寄主专一性的诊断标记。苹果褐斑病（Marssonina apple blotch）也是苹果生产中的主要病害之一，其致病菌苹果褐斑病菌（Diplocarpon mali），主要通过侵染生长期的苹果叶片、嫩枝、果实等引起寄主发病并大量落叶，进而削弱树势，影响果实产量和品质[3435]。Li 等[36]利用蛋白质双向电泳结合MALDITOFTOF质谱检测，分析了‘秦冠’苹果叶片经苹果盘二孢菌（Marssonina coronaria）侵染前后的差异蛋白质表达情况。通过对35个差异蛋白质点的功能分析，系统分析了抗氧化相关、防御及胁迫反应相关蛋白的差异表达情况，并探讨了其中的内切几丁质酶3（class Ⅲ endochitinase， PR3）、β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanases，PR2）、类甜蛋白（thaumatinlike protein，PR5）等3个病程相关蛋白与苹果属植物寄主抗病反应的相关性。
苹果黑星病（apple scab）是世界性的真菌性病害，其致病菌Venturia inaequalis主要通过侵染苹果枝条、果实而引起寄主大面积发病，成为苹果产区的重要病害。Gau 等[37]以易感病的苹果栽培品种‘Elstar’为研究对象，通过SDSPAGE 结合2DE技术，分析其叶片经黑星病菌（V.inaequalis）侵染前后，叶片细胞内非原质体蛋白的差异表达情况。进一步结合免疫印迹分析，证实叶片细胞应答黑星病菌侵染前后，非原质体内β1，3葡聚糖酶、几丁质酶、类甜蛋白等病程相关蛋白为关键的抗病相关蛋白。
苹果斑点落叶病是目前我国苹果主产区的主要病害之一。张彩霞等[38]以苹果叶片与斑点落叶病菌（A.alternata apple pathotype）为研究对象，通过双向电泳方法比较了病原菌胁迫过程中苹果叶片总蛋白的差异表达情况，再经MALDITOFTO质谱检测及功能检索，共获得20个蛋白点的功能信息，探讨了其中抗病反应相关的抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）以及苹果过敏原Mal d1苹果叶片应答病原菌胁迫过程中的关键作用，为进一步开展苹果抗病分子机制研究提供参考。 苹果采后经常会受到各种生物、非生物胁迫，引起严重的经济损失。BuronMoles 等[39]为了解苹果果实应答各种胁迫的防御反应机制，研究了苹果果实在机械损伤、病原菌侵染等条件下的氧化反应相关蛋白的差异表达。进一步通过质谱分析结合蛋白质羰基含量检测，共获得27个活性氧（ROS）代谢相关的差异表达蛋白，其中高丰度表达的ACC氧化酶及2个谷氨酰胺合成酶可能是影响苹果果实应答机械损伤及病原菌胁迫的关键蛋白。
4 蛋白质组学分析技术在苹果属植物相关研究中存在的问题
当前，蛋白质组学分析技术仍存在许多技术上的缺陷，制约其大规模发展。例如，受分析检测技术灵敏度的制约，基于2DE分析的苹果属植物应答病原菌胁迫蛋白质组学研究中，虽然已经鉴定获得大量差异蛋白点功能信息，仍有部分差异蛋白质点得不到成功鉴定，致使无法完整获得寄主应答反应的分子机制。
此外，传统2DE分析中低丰度蛋白的获得及蛋白质样品的定量问题也是制约苹果属植物蛋白质组学研究的关键问题。近几年发展的灵敏度较高的iTRAQ以及LCMS/MS技术，在一定程度上解决了蛋白质样品的定量问题。
苹果基因组数据的公布[26]，推动了苹果属植物蛋白质组学研究的迅速发展。然而，与模式植物相比，基因组数据库中仍有大量的功能基因未得到成功验证，进而限制了苹果属植物蛋白质组数据库的完整性，因此，迫切需要开展大量基因功能研究，不断补充和完善苹果基因组数据库。
5 小结与展望
总之，关于苹果属植物寄主应答病原菌胁迫过程的研究发现，寄主可以通过启动多个途径来实现对病原菌胁迫的防御或响应，包括光合作用、能量代谢、胁迫及防御反应等相关蛋白的差异表达，其中病程相关的PR类蛋白在植物寄主应答病原菌胁迫过程中可能起到关键作用，还需要对这些蛋白进行深入的分析，如利用反向遗传学策略（目标基因过表达或RNAi干涉技术）对关键目标蛋白进行功能分析，来明确调控苹果寄主抗病相关的功能蛋白。
近年来，针对生物机体开展综合性研究已成为一种趋势，其中，高通量组学（omics）技术，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以及传统的生物化学、细胞生物学等学科技术的相互交叉、验证，对于深入认识生命活动的内在机制具有重要意义[40]。
迄今为止，关于苹果属植物的蛋白质组学研究多集中于2DE电泳，MALDITOF质谱分析，鉴于植物寄主应答病原菌侵染的复杂性，需要开展更加深入的研究，如参考模式植物上开展的蛋白质定位、蛋白质相互作用、蛋白质芯片、酵母双杂交等技术，以系统认识苹果属植物应答病原菌胁迫时所启动的抗性机制，充实果树抗病的分子理论研究。
参考文献
[1]Bednarek P， Osbourn A.Plantmicrobe interactions： chemical diversity in plant defense [J]. Science， 2009， 324： 746748.
[2]Mayer M，Oberhuber C，Loncaric I，et al.Fireblight （Erwinia amylovora） affects Mal d 1related allergenicity in apple [J].European Journal of Plant Pathology，2011，131（1）：17.
[3]Soh H C， Park A R， Park S， et al. Comparative analysis of pathogenesisrelated protein 10（PR10） genes between fungal resistant and susceptible peppers[J]. European Journal of Plant Pathology， 2012， 132（1）： 3748.
[4]Jurick W M， Janisiewicz W J， Saftner R A， et al. Identification of wild apple germplasm （Malus spp.） accessions with resistance to the postharvest decay pathogens Penicillium expansum and Colletotrichum acutatum[J]. Plant Breeding， 2011， 130（4）： 481486.
[5]Volk G M， Richards C M， Reilley A A， et al.Genetic diversity and disease resistance of wild Malus orientalis from Turkey and southern Russia [J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2008， 133（3）： 383389.
[6]Montesinos E， Bonaterra A， Badosa E， et al. Plantmicrobe interactions and the new biotechnological methods of plant disease control [J]. International Microbiology， 2002， 5（4）： 169175.
[7]Choi H W， Lee B G， Kim N H， et al. A role for a menthone reductase in resistance against microbial pathogens in plants[J]. Plant Physiology， 2008， 148（1）： 383401. [8]Li Z T， Dhekney S A， Gray D J.PR1 gene family of grapevine： a uniquely duplicated PR1 gene from a Vitis interspecific hybrid confers high level resistance to bacterial disease in transgenic tobacco [J].Plant Cell Reports，2011，30（1）：111.
[9]Duffy B， Keel C， Defago G.Potential role of pathogen signaling in multitrophic plantmicrobe interactions involved in disease protection [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（3）： 18361842.
[10]Pandey A， Mann M.Proteomics to study genes and genomes[J]. Nature， 2000， 405： 837846.
[11]van Loon L C， Rep M， Pieterse C M J.Significance of inducible defenserelated proteins in infected plants [J]. Annual Review of Phytopathology， 2006， 44：135162.
[12]Chivasa S， Hamilton J M， Pringle R S， et al. Proteomic analysis of differentially expressed proteins in fungal elicitortreated Arabidopsis cell cultures [J]. Journal of Experimental Botany， 2006， 57： 15531562.
[13]Kim S T， Kang Y H， Wang Y， et al. Secretome analysis of differentially induced proteins in rice suspensioncultured cells triggered by rice blast fungus and elicitor[J]. Proteomics， 2009， 9： 13021313.
[14]Campo S， Carrascal M， Coca M， et al. The defence response of germinating maize embryos against fungal infection： a proteomics approach [J]. Proteomics， 2004， 4： 383396.
[15]Houterman P M， Speijer D， Dekker H L， et al. The mixed xylem sap proteome of Fusarium oxysporuminfected tomato plants [J]. Molecular Plant Pathology， 2007， 8： 215221.
[16]曹尚银， 张秋明， 郭俊英， 等. 蛋白质组学研究技术及其在果树学中的应用[J]. 果树学报，2005， 22（2）： 138142.
[17]Rampitsch C， Bykova N V.Proteomics and plant disease： advances in combating a major threat to the global food supply[J]. Proteomics， 2012， 12： 673690.
[18]Pedreschi R， Hertog M， Robben J， et al. Gelbased proteomics approach to the study of metabolic changes in pear tissue during storage [J]. Journal of Agriculture Food Chemistry， 2009， 57（15）： 69977004.
[19]Nilo R， Saffie C， Lilley K， et al. Proteomic analysis of peach fruit mesocarp softening and chilling injury using difference gel electrophoresis （DIGE）[J].BMC Genomics，2010，11：4362.
[20]Carpentier S C， Witters E， Laukens K， et al. Banana （Musa spp.） as a model to study the meristem proteome： Acclimation to osmotic stress [J]. Proteomics， 2007， 7（1）： 92105.
[21]Carpentier S C， Witters E， Laukens K， et al. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues： An evaluation of different methods for twodimensional gel electrophoresis analysis [J]. Proteomics， 2005， 5（10）：24972507. [22]朱志勇， 曹尚银， 徐小彪， 等. 新红星苹果花芽蛋白质提取及双向电泳的改良方法[J]. 果树学报， 2007， 24（4）： 549552.
[23]曾广娟，李春敏，张新忠，等.苹果实生树阶段转变特异蛋白质的SDSPAGE分析[J]. 园艺学报，2008，35（7）：10591064.
[24]曹尚银，张秋明， 朱志勇， 等. 苹果花芽孕育蛋白质组学初步分析[J]. 中国农业科学， 2007， 40（10）： 22812288.
[25]张彩霞， 陈莹， 李壮， 等. 苹果叶片总蛋白提取及其双向电泳分析[J]. 果树学报， 2012， 29（3）： 488492.
[26]Velasco R， Zharkikh A， Affourtit J， et al. The genome of the domesticated apple（Malus×domestica Borkh.）[J]. Nature Genetics， 2010， 42（10）： 833839.
[27]BuronMoles G， Torres R， AmoakoAndoh F， et al. Analysis of changes in protein abundance after wounding in ‘Golden Delicious’ apples [J]. Postharvest Biology and Technology， 2014， 87： 5160.
[28]Khan M A， Zhao Y F， Korban S S.Molecular mechanisms of pathogenesis and resistance to the bacterial pathogen Erwinia amylovora， causal agent of fire blight disease in Rosaceae [J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2012， 30（2）： 247260.
[29]Oh C S， Beer S V.Molecular genetics of Erwinia amylovora involved in the development of fire blight [J]. FEMS Microbiology Letters， 2005， 253（2）：185192.
[30]Ozrenk K， Balta F， Guleryuz M， et al. Fire blight （Erwinia amylovora） resistant/susceptibility of native apple germplasm from eastern Turkey [J]. Crop Protection，2011，30（5）：526530.
[31]Meng X D， Bonasera J M， Kim J F， et al. Apple proteins that interact with DspA/E， a pathogenicity effector of Erwinia amylovora， the fire blight pathogen [J]. Molecular PlantMicrobe Interactions， 2006， 19（1）： 5361.
[32]Gril T， Celar F， Munda A， et al. AFLP analysis of intraspecific variation between Monilinia laxa isolates from different hosts [J]. Plant Disease， 2008， 92（12）： 16161624.
[33]Bregar O， Mandelc S， Celar F， et al. Proteome analysis of the plant pathogenic fungus Monilinia laxa showing host specificity [J]. Food Technology and Biotechnology，2012，50（3）：326333.
[34]Sagong D H， Kweon H J， Song Y Y.Influence of defoliation by Marssonina blotch on vegetative growth and fruit quality in Korean [J]. The Journal of Horticultural Science and Technology， 2011， 29（6）： 531538.
[35]Sharma J N，Sharma A，Sharma P.Outbreak of Marssonina blotch in warmer climates causing premature leaf fall problem of apple and its management [J].Acta Horticulturae，2004，662：405409.
[36]Li M M， Xu J H， Qin Z H， et al. Screening and identification of resistance related proteins from apple leaves inoculated with Marssonina coronaria （EII.
关键词 苹果； 病原菌； 蛋白质组学； 研究进展
中图分类号： S 432.2
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2015.06.003
Abstract Rapid development of apple genome research builds up an important basis for proteomics research of Malus spp. In recent years， proteomics approaches played a key role in exploring the differential expression of defenserelated proteins induced by the pathogens， and understanding the molecular mechanism of apple host resistance to the pathogens. Based on the application of proteomics approaches on fruit trees， we review the apple proteomics studies， including the resistancerelated proteins of apple host induced by some main diseases in apple production， such as fire blight， Marssonina apple blotch， and apple scab， which will provide some clues to a comprehensive understanding of the molecular mechanism of apple host resistance to the pathogens.
Key words apple； pathogen； proteomics； progress
以往关于模式植物抗病分子机制研究表明，植物寄主应答病原菌胁迫时，寄主细胞自身免疫受体（抗病蛋白）能够识别病原菌效应因子，进而诱发寄主细胞自身抗病反应，实现对病原菌胁迫信号的响应、传递以及生物学防御[13]。
目前，国内外苹果产业已进入快速发展期，然而，迄今为止，各种病害的发生仍然是制约苹果产业发展的瓶颈，由此，各国育种部门逐渐关注以提高果树自身抗性为目标的抗性育种研究[45]。由于苹果属多年生木本植物，童期较长、且遗传背景高度杂合，常规的育种手段很难在短期内培育出高抗优质的新种质。分子生物学技术的不断发展和完善，为系统了解苹果属植物响应病原菌胁迫的防御反应过程提供了技术参考。近年不断发展的基因组学、蛋白质组学研究，使得挖掘抗病相关功能基因或蛋白，并利用基因工程手段加快苹果抗病种质的遗传改良研究成为现实。开展植物寄主与病原菌互作的差异蛋白质组学研究，将有助于从分子水平上了解植物寄主应答病原菌胁迫的抗病机制。本文就近年来国内外关于苹果属植物应答病原真菌胁迫的蛋白质组学研究作一概述，以期为进一步应用蛋白质组学方法探究苹果属植物抗病的分子机制提供参考。
1 植物寄主应答病原菌胁迫的抗病机制
病原菌是导致植物寄主发病的生物胁迫因子。在自然条件下，植物寄主与病原菌互作涉及复杂的防御反应过程，包括细胞壁增厚、各种抗病相关蛋白的诱导表达及毒素的分泌等[1，67]。此外，植物寄主应答病原菌侵染的抗病或感病反应与其自身的免疫系统相关，包括寄主与病原菌间的相互识别、相互竞争[1]。
通过对胡椒、烟草等植物的抗病分子机制研究发现，植物寄主应答病原菌胁迫时，常通过寄主细胞内某些抗性相关蛋白的特异性表达，影响或抵御病原菌的进一步侵染[3，8]。
抗病反应涉及多种抗性相关蛋白的表达，如病程相关蛋白（pathogenesis related protein，PR）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、热激蛋白（Hsp）、氧化胁迫反应相关蛋白以及其他次生代谢蛋白等（图1）[1，10]。
其中，PR类蛋白是植物寄主在抗病反应过程中产生的一类具有广谱抗性的可溶性蛋白[1，910]，目前，关于其基因表达调控的分子机制研究取得了很大进展[3，8]。根据PR蛋白的植物来源、氨基酸序列同源性以及生化功能等，可将PR蛋白分为17类[11]，包括：富含甘氨酸的PR蛋白（PR1）、β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanases） （PR2）、几丁质酶（chitinase） （PR3）、类甜蛋白（thaumatinlike protein）（PR5）、过氧化物酶类（peroxidases）（PR9）、过敏反应相关的PR蛋白（PR10）等。研究表明，其中的PR2、PR3、PR5以及PR9等PR类蛋白能有效抑制病原菌的生长和扩散，已被鉴定为具有潜在抗真菌活性的抗病蛋白[1，3， 810]。
研究表明，寄主细胞内PR类蛋白的特异性表达对病原菌致病能力的发挥具有重要影响。目前，植物寄主响应病原真菌胁迫的蛋白质组学研究在拟南芥、水稻、玉米、番茄等模式植物中已得到广泛开展，大量的抗病相关蛋白已被成功鉴定[1215]。 2 蛋白质组学研究技术在果树研究中的应用
近年来，随着功能基因组学研究方法的不断发展，蛋白质组学（proteomics）技术作为功能基因组学研究的重要支柱，已成为分子生物学领域的前沿学科，其技术的日趋成熟与完善，已能实现在蛋白质水平上以高通量方式直接研究基因功能[10， 16]。
相较于稳定的基因组信息，蛋白质组具备其动态变化的特殊性，如结构的形成、修饰、定位、相互作用等，这些信息均无法直接从基因组信息中获得。因此，若要精确地研究基因的功能，解释复杂的生命现象，就必然要在定量、整体、动态的水平上对基因表达产物（蛋白质）进行研究，即进行蛋白质组学的研究[17]。蛋白质组学研究的不断发展，也为苹果属植物相关研究创造了良好的技术体系。
近几年，随着果树基因组研究工作的不断深入和完善，蛋白质组学分析技术已经应用于梨[18]、桃[19]、香蕉[20]等多年生果树品种研究上，关于苹果属植物材料蛋白质组学方面的研究也已陆续开展[2125]。2010年公布了 ‘金冠’（Golden delicious）苹果的全基因组草图[26]，其测序结果所产生的海量数据，为苹果属植物蛋白质组学、基因组学等相关研究的开展奠定了重要基础。
苹果果皮较薄，采摘前后很容易受到机械损伤，而形成的伤口又为其他病原菌的侵染制造了机会。BuronMoles 等[27]以‘金冠’苹果为研究对象，分析了机械伤害处理前后，果实总蛋白的差异表达情况。研究发现，果实经机械伤害处理48 h后，其差异表达蛋白主要为胁迫反应相关蛋白，包括β1，3葡聚糖酶等病程相关的PR类蛋白，该研究为充分认识苹果属植物应答机械损伤胁迫的抗性机制提供参考。
3 苹果属植物应答病原菌胁迫的蛋白质组学研究
目前，利用成熟的蛋白质组学分析技术，在苹果属植物寄主应答病原菌研究中，已筛选获得大量由病原菌诱导产生，来源于寄主的功能蛋白。此外，还明确了各类蛋白，尤其是病程相关PR类蛋白，在苹果属植物防御反应机制中的具体作用，为开展相关的基因组学和转录组学研究提供了重要参考。
由欧文氏细菌（Erwinia amylovora） 侵染而引发的火疫病（fire blight），是苹果及其他蔷薇科植物的毁灭性病害，已成为影响苹果、梨产业发展的重要病害之一[28]。目前，关于苹果属植物寄主与火疫病致病菌互作方面的研究，主要集中于病原菌致病机理，尤其是互作过程中效应蛋白（effector proteins）的分泌及其转运途径研究[2930]，研究发现，苹果属植物寄主应答火疫病菌侵染，主要依赖于自身抗性基因与致病菌效应因子的亲和性或非亲和性互作，包括病原菌致病相关的两类效应蛋白（DspE和HrpN）与苹果寄主细胞抗病基因的互作，进而产生抗病或感病反应[31]。苹果褐腐病（brown rot）是由链核盘菌（Monilinia laxa）侵染苹果花、幼苗及嫩枝引起的真菌性病害，主要表现为果实成熟期落果，或采后贮存期腐烂[32]。为了探讨褐腐病病菌对仁果类、核果类寄主的专一性，Bregar 等[33]利用差异蛋白质组学方法，以从苹果、杏发病果实上分离纯化的褐腐病菌为研究试材，比较了两种寄主分离菌的总蛋白表达谱。通过对软件分析获得的50个差异蛋白点进行质谱检测，共有41个蛋白点被成功鉴定，依据功能信息可划分为蛋白质代谢、能量产生、糖代谢、胁迫反应、脂肪酸代谢及其他蛋白等6类。通过比较分析发现，某些已经研究证实的毒性因子蛋白仅在苹果分离菌株中有表达，然而，关于这些蛋白的寄主专一性机制仍不清楚。该研究共获得10个仅在苹果分离菌中特异表达的差异蛋白，其中乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）上调量达11倍，表明该蛋白有可能作为苹果褐腐病寄主专一性的诊断标记。苹果褐斑病（Marssonina apple blotch）也是苹果生产中的主要病害之一，其致病菌苹果褐斑病菌（Diplocarpon mali），主要通过侵染生长期的苹果叶片、嫩枝、果实等引起寄主发病并大量落叶，进而削弱树势，影响果实产量和品质[3435]。Li 等[36]利用蛋白质双向电泳结合MALDITOFTOF质谱检测，分析了‘秦冠’苹果叶片经苹果盘二孢菌（Marssonina coronaria）侵染前后的差异蛋白质表达情况。通过对35个差异蛋白质点的功能分析，系统分析了抗氧化相关、防御及胁迫反应相关蛋白的差异表达情况，并探讨了其中的内切几丁质酶3（class Ⅲ endochitinase， PR3）、β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanases，PR2）、类甜蛋白（thaumatinlike protein，PR5）等3个病程相关蛋白与苹果属植物寄主抗病反应的相关性。
苹果黑星病（apple scab）是世界性的真菌性病害，其致病菌Venturia inaequalis主要通过侵染苹果枝条、果实而引起寄主大面积发病，成为苹果产区的重要病害。Gau 等[37]以易感病的苹果栽培品种‘Elstar’为研究对象，通过SDSPAGE 结合2DE技术，分析其叶片经黑星病菌（V.inaequalis）侵染前后，叶片细胞内非原质体蛋白的差异表达情况。进一步结合免疫印迹分析，证实叶片细胞应答黑星病菌侵染前后，非原质体内β1，3葡聚糖酶、几丁质酶、类甜蛋白等病程相关蛋白为关键的抗病相关蛋白。
苹果斑点落叶病是目前我国苹果主产区的主要病害之一。张彩霞等[38]以苹果叶片与斑点落叶病菌（A.alternata apple pathotype）为研究对象，通过双向电泳方法比较了病原菌胁迫过程中苹果叶片总蛋白的差异表达情况，再经MALDITOFTO质谱检测及功能检索，共获得20个蛋白点的功能信息，探讨了其中抗病反应相关的抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）以及苹果过敏原Mal d1苹果叶片应答病原菌胁迫过程中的关键作用，为进一步开展苹果抗病分子机制研究提供参考。 苹果采后经常会受到各种生物、非生物胁迫，引起严重的经济损失。BuronMoles 等[39]为了解苹果果实应答各种胁迫的防御反应机制，研究了苹果果实在机械损伤、病原菌侵染等条件下的氧化反应相关蛋白的差异表达。进一步通过质谱分析结合蛋白质羰基含量检测，共获得27个活性氧（ROS）代谢相关的差异表达蛋白，其中高丰度表达的ACC氧化酶及2个谷氨酰胺合成酶可能是影响苹果果实应答机械损伤及病原菌胁迫的关键蛋白。
4 蛋白质组学分析技术在苹果属植物相关研究中存在的问题
当前，蛋白质组学分析技术仍存在许多技术上的缺陷，制约其大规模发展。例如，受分析检测技术灵敏度的制约，基于2DE分析的苹果属植物应答病原菌胁迫蛋白质组学研究中，虽然已经鉴定获得大量差异蛋白点功能信息，仍有部分差异蛋白质点得不到成功鉴定，致使无法完整获得寄主应答反应的分子机制。
此外，传统2DE分析中低丰度蛋白的获得及蛋白质样品的定量问题也是制约苹果属植物蛋白质组学研究的关键问题。近几年发展的灵敏度较高的iTRAQ以及LCMS/MS技术，在一定程度上解决了蛋白质样品的定量问题。
苹果基因组数据的公布[26]，推动了苹果属植物蛋白质组学研究的迅速发展。然而，与模式植物相比，基因组数据库中仍有大量的功能基因未得到成功验证，进而限制了苹果属植物蛋白质组数据库的完整性，因此，迫切需要开展大量基因功能研究，不断补充和完善苹果基因组数据库。
5 小结与展望
总之，关于苹果属植物寄主应答病原菌胁迫过程的研究发现，寄主可以通过启动多个途径来实现对病原菌胁迫的防御或响应，包括光合作用、能量代谢、胁迫及防御反应等相关蛋白的差异表达，其中病程相关的PR类蛋白在植物寄主应答病原菌胁迫过程中可能起到关键作用，还需要对这些蛋白进行深入的分析，如利用反向遗传学策略（目标基因过表达或RNAi干涉技术）对关键目标蛋白进行功能分析，来明确调控苹果寄主抗病相关的功能蛋白。
近年来，针对生物机体开展综合性研究已成为一种趋势，其中，高通量组学（omics）技术，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以及传统的生物化学、细胞生物学等学科技术的相互交叉、验证，对于深入认识生命活动的内在机制具有重要意义[40]。
迄今为止，关于苹果属植物的蛋白质组学研究多集中于2DE电泳，MALDITOF质谱分析，鉴于植物寄主应答病原菌侵染的复杂性，需要开展更加深入的研究，如参考模式植物上开展的蛋白质定位、蛋白质相互作用、蛋白质芯片、酵母双杂交等技术，以系统认识苹果属植物应答病原菌胁迫时所启动的抗性机制，充实果树抗病的分子理论研究。
参考文献
[1]Bednarek P， Osbourn A.Plantmicrobe interactions： chemical diversity in plant defense [J]. Science， 2009， 324： 746748.
[2]Mayer M，Oberhuber C，Loncaric I，et al.Fireblight （Erwinia amylovora） affects Mal d 1related allergenicity in apple [J].European Journal of Plant Pathology，2011，131（1）：17.
[3]Soh H C， Park A R， Park S， et al. Comparative analysis of pathogenesisrelated protein 10（PR10） genes between fungal resistant and susceptible peppers[J]. European Journal of Plant Pathology， 2012， 132（1）： 3748.
[4]Jurick W M， Janisiewicz W J， Saftner R A， et al. Identification of wild apple germplasm （Malus spp.） accessions with resistance to the postharvest decay pathogens Penicillium expansum and Colletotrichum acutatum[J]. Plant Breeding， 2011， 130（4）： 481486.
[5]Volk G M， Richards C M， Reilley A A， et al.Genetic diversity and disease resistance of wild Malus orientalis from Turkey and southern Russia [J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2008， 133（3）： 383389.
[6]Montesinos E， Bonaterra A， Badosa E， et al. Plantmicrobe interactions and the new biotechnological methods of plant disease control [J]. International Microbiology， 2002， 5（4）： 169175.
[7]Choi H W， Lee B G， Kim N H， et al. A role for a menthone reductase in resistance against microbial pathogens in plants[J]. Plant Physiology， 2008， 148（1）： 383401. [8]Li Z T， Dhekney S A， Gray D J.PR1 gene family of grapevine： a uniquely duplicated PR1 gene from a Vitis interspecific hybrid confers high level resistance to bacterial disease in transgenic tobacco [J].Plant Cell Reports，2011，30（1）：111.
[9]Duffy B， Keel C， Defago G.Potential role of pathogen signaling in multitrophic plantmicrobe interactions involved in disease protection [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（3）： 18361842.
[10]Pandey A， Mann M.Proteomics to study genes and genomes[J]. Nature， 2000， 405： 837846.
[11]van Loon L C， Rep M， Pieterse C M J.Significance of inducible defenserelated proteins in infected plants [J]. Annual Review of Phytopathology， 2006， 44：135162.
[12]Chivasa S， Hamilton J M， Pringle R S， et al. Proteomic analysis of differentially expressed proteins in fungal elicitortreated Arabidopsis cell cultures [J]. Journal of Experimental Botany， 2006， 57： 15531562.
[13]Kim S T， Kang Y H， Wang Y， et al. Secretome analysis of differentially induced proteins in rice suspensioncultured cells triggered by rice blast fungus and elicitor[J]. Proteomics， 2009， 9： 13021313.
[14]Campo S， Carrascal M， Coca M， et al. The defence response of germinating maize embryos against fungal infection： a proteomics approach [J]. Proteomics， 2004， 4： 383396.
[15]Houterman P M， Speijer D， Dekker H L， et al. The mixed xylem sap proteome of Fusarium oxysporuminfected tomato plants [J]. Molecular Plant Pathology， 2007， 8： 215221.
[16]曹尚银， 张秋明， 郭俊英， 等. 蛋白质组学研究技术及其在果树学中的应用[J]. 果树学报，2005， 22（2）： 138142.
[17]Rampitsch C， Bykova N V.Proteomics and plant disease： advances in combating a major threat to the global food supply[J]. Proteomics， 2012， 12： 673690.
[18]Pedreschi R， Hertog M， Robben J， et al. Gelbased proteomics approach to the study of metabolic changes in pear tissue during storage [J]. Journal of Agriculture Food Chemistry， 2009， 57（15）： 69977004.
[19]Nilo R， Saffie C， Lilley K， et al. Proteomic analysis of peach fruit mesocarp softening and chilling injury using difference gel electrophoresis （DIGE）[J].BMC Genomics，2010，11：4362.
[20]Carpentier S C， Witters E， Laukens K， et al. Banana （Musa spp.） as a model to study the meristem proteome： Acclimation to osmotic stress [J]. Proteomics， 2007， 7（1）： 92105.
[21]Carpentier S C， Witters E， Laukens K， et al. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues： An evaluation of different methods for twodimensional gel electrophoresis analysis [J]. Proteomics， 2005， 5（10）：24972507. [22]朱志勇， 曹尚银， 徐小彪， 等. 新红星苹果花芽蛋白质提取及双向电泳的改良方法[J]. 果树学报， 2007， 24（4）： 549552.
[23]曾广娟，李春敏，张新忠，等.苹果实生树阶段转变特异蛋白质的SDSPAGE分析[J]. 园艺学报，2008，35（7）：10591064.
[24]曹尚银，张秋明， 朱志勇， 等. 苹果花芽孕育蛋白质组学初步分析[J]. 中国农业科学， 2007， 40（10）： 22812288.
[25]张彩霞， 陈莹， 李壮， 等. 苹果叶片总蛋白提取及其双向电泳分析[J]. 果树学报， 2012， 29（3）： 488492.
[26]Velasco R， Zharkikh A， Affourtit J， et al. The genome of the domesticated apple（Malus×domestica Borkh.）[J]. Nature Genetics， 2010， 42（10）： 833839.
[27]BuronMoles G， Torres R， AmoakoAndoh F， et al. Analysis of changes in protein abundance after wounding in ‘Golden Delicious’ apples [J]. Postharvest Biology and Technology， 2014， 87： 5160.
[28]Khan M A， Zhao Y F， Korban S S.Molecular mechanisms of pathogenesis and resistance to the bacterial pathogen Erwinia amylovora， causal agent of fire blight disease in Rosaceae [J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2012， 30（2）： 247260.
[29]Oh C S， Beer S V.Molecular genetics of Erwinia amylovora involved in the development of fire blight [J]. FEMS Microbiology Letters， 2005， 253（2）：185192.
[30]Ozrenk K， Balta F， Guleryuz M， et al. Fire blight （Erwinia amylovora） resistant/susceptibility of native apple germplasm from eastern Turkey [J]. Crop Protection，2011，30（5）：526530.
[31]Meng X D， Bonasera J M， Kim J F， et al. Apple proteins that interact with DspA/E， a pathogenicity effector of Erwinia amylovora， the fire blight pathogen [J]. Molecular PlantMicrobe Interactions， 2006， 19（1）： 5361.
[32]Gril T， Celar F， Munda A， et al. AFLP analysis of intraspecific variation between Monilinia laxa isolates from different hosts [J]. Plant Disease， 2008， 92（12）： 16161624.
[33]Bregar O， Mandelc S， Celar F， et al. Proteome analysis of the plant pathogenic fungus Monilinia laxa showing host specificity [J]. Food Technology and Biotechnology，2012，50（3）：326333.
[34]Sagong D H， Kweon H J， Song Y Y.Influence of defoliation by Marssonina blotch on vegetative growth and fruit quality in Korean [J]. The Journal of Horticultural Science and Technology， 2011， 29（6）： 531538.
[35]Sharma J N，Sharma A，Sharma P.Outbreak of Marssonina blotch in warmer climates causing premature leaf fall problem of apple and its management [J].Acta Horticulturae，2004，662：405409.
[36]Li M M， Xu J H， Qin Z H， et al. Screening and identification of resistance related proteins from apple leaves inoculated with Marssonina coronaria （EII.