论文部分内容阅读
摘要 本研究以对多种植物病原真菌具有抑制能力的解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens262AG6为试验对象，使用单因素和正交试验设计方法对其发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明，最优发酵培养基为马铃薯200 g，葡萄糖25 g，KNO3 16 g，NaCl 15 g，水1 000 mL；最优发酵条件为温度34℃，150 mL摇瓶装液40 mL，振荡器转速150 r/min，培养基初始pH 9，最佳接种量为14%；其在100 L发酵罐的生长曲线为0～6 h为调整期，6～26 h为对数期，26 h后菌株进入稳定期，即该菌最佳放罐时间为26 h。
关键词 矮生嵩草； 解淀粉芽胞杆菌； 发酵培养基； 发酵条件； 优化
中图分类号： TQ 920.6
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2018027
Abstract Bacillus amyloliquefaciens 262AG6 has inhibitory activity against a variety of plant pathogenic fungi. Single-factor and orthogonal experimental design methods were used to optimize the fermentation conditions of this bacterium. The results showed that the optimum fermentation medium included 200 g of potato， 25 g of glucose， 16 g of KNO3， 15 g of NaCl in 1 000 mL of water. The optimal fermentation conditions were as followed： shaking 40 mL liquid （the best inoculum size was 14%） in an 150 mL bottle at 150 r/min at 34℃， with an initial pH value of 9； its growth curve in the 100 L fermenter was composed of 0-6 h for the adjustment period， 6-26 h for the logarithmic phase， and the stable period after 26 h， suggesting a best fermentation time of 26 h.
Key words Kobresia humilis； Bacillus amyloliquefaciens； fermentation medium； fermentation condition； optimization
微生物發酵是指在适宜的条件下，利用微生物将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需产物的过程[1]。微生物发酵工程具有极其强劲的发展动力，在许多学科领域发挥着不可替代的作用，微生物发酵同样是生防微生物从实验室培养研究到工业化生产实践应用过程中必须跨越的台阶。内生细菌作为一种宝贵的天然微生物资源，在宿主防病、杀虫、促生、耐盐及耐干旱等能力提升方面得到了国内外学者的广泛关注[2]，很多植保工作者对生防微生物及其发酵优化进行了研究报道，刘宁等[3]发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilisBAB-1的无菌发酵液在离体叶片上对番茄灰霉病的防治效果达70.92%；刘旭等[4]的研究发现解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciensCS5菌株对葡萄离体叶片上的霜霉病防治效果达96.23%；蔡丽等[5]的研究表明内生细菌FH01的最佳发酵条件为麦芽提取物1.43%（m/v）， 大豆蛋白胨1.67%（m/v）， 初始pH 5.0，发酵温度37℃，摇床转速130 r/min，发酵时间68 h；李乔曼等[6]研究发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis LYM3的发酵上清液具有较高的抗菌活性，通过优化其最适培养基组成为：可溶性淀粉2%、胰蛋白胨1%、酵母粉0.8%、NaCl 1%，初始pH 6.0，28℃，180 r/min，发酵培养60 h，抗菌活性物质产量达到最高；雷白时等[7]对棉花黄萎病菌Verticillium dahliae的拮抗菌多黏芽胞杆菌Bacillus polymyxa7-4产抑菌蛋白的发酵条件进行了优化，发现其最佳培养基组分为：葡萄糖5.0%，大豆蛋白胨5.0%，MgSO4·7H2O 0.10%，MnSO4 0.02%，初始pH 7.5，30℃摇床培养48 h，可以提高对大丽轮枝菌的抑制作用。
解淀粉芽胞杆菌菌株262AG6是本实验室从东祁连山高寒草地矮生嵩草中分离的具有抑菌活性和多种促生功能的优良内生细菌，本试验旨在通过优化其最适发酵培养基和发酵条件，以期为该菌株的工业化生产提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
供试菌株为甘肃农业大学植物保护学院保存的东祁连山高寒草地矮生嵩草内生细菌解淀粉芽胞杆菌262AG6。
1.1.2 供试培养基[8-9]
肉汁胨培养基（NA）用于内生细菌262AG6的活化、保存等。培养基A～G用作基础培养基筛选。A：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL；B：马铃薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL；C：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖8 g，NaCl 5 g，水1 000 mL；D：牛肉膏8 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，水1 000 mL；E：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL；F：玉米淀粉3 g，（NH4）2SO4 10 g，KH2PO4 15 g，蔗糖10 g，水1 000 mL；G：牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，水1 000 mL。 1.1.3 试验仪器设备
BIOF-6100B/S/B/N微生物发酵罐，上海高机生物工程有限公司；紫外/可见光分光光度计，上海洪纪仪器设备有限公司，用于测定发酵液的OD600。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株262AG6的活化和种子液的制备
将保存的262AG6菌株接种于NA培养基上于28℃培养箱中活化，然后接入NA液体培养基中在28℃、180 r/min的条件下过夜培养，制得种子液备用（液体培养基在150 mL的锥形瓶中装液量为50 mL）。
1.2.2 基础培养基的优化
将1.1.2中A～G培养液分装入锥形瓶（40 mL/150 mL），调节pH 为7后灭菌，再接入种子液2 mL，恒温振荡器中振荡培养（28℃，180 r/min），3次重复，培养24 h后通过发酵液的OD600确定生物量，以确定最佳基础培养基。
1.2.3 碳源、氮源和无机盐的优化
用蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、无碳源、葡萄糖分别替换1.2.2筛选出的基础培养基中的碳源，其他同1.2.2，以确定最佳碳源。
用尿素、（NH4）2SO4、KNO3、NH4Cl、酵母膏、不加氮、蛋白胨、牛肉膏分别替换1.2.2筛选出的基础培养基中的氮源，其他同1.2.2，以确定最佳氮源。
用MgSO4、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、CaCl2、不加无机盐离子、NaCl分别替换1.2.2筛选出的基础培养基中的无机盐，其他同1.2.2，以确定最佳无机盐。
1.2.4 最佳碳源、氮源和无机盐浓度的确定
将1.2.3筛选出的最佳碳源分别设置为0、5、10、15、20、25和30g/L、其他同1.2.2，以确定碳源的最适浓度。
将1.2.3筛选出的最佳氮源分别设置为0、4、6、8、10、12、14和16g/L，其他同1.2.2，以确定氮源的最适浓度。
将1.2.3筛选出的最佳无机盐分别设置0、5、10、15、20、25、30、35和40 g/L，其他同1.2.2，以确定无机盐的最适浓度。
1.2.5 碳源、氮源和无机盐的正交试验
根据1.2.3和1.2.4的筛选结果进行L9（3.3）正交试验（表1），28℃，180 r/min条件下培养24 h后测定发酵液的吸光度（OD600），结果经方差检验分析，确定最佳的培养基组合。
1.2.6 摇瓶培养条件优化
设定pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和自然pH，温度为20、24、28、32、34和36℃，恒温振荡器转速为120、150、180、210和240 r/min，摇瓶供氧量设置150 mL锥形瓶培养基装液量为20、40、60、80和100 mL，接种量为2%、6%、10%、14%、18%和22%。利用上述培养条件，在1.2.5最佳培养基组合的基础上，使用单因素试验的方法培养生防菌株262AG6，通过测定发酵液的吸光度（OD600）确定生物量，优化最佳发酵培养条件。
1.2.7 发酵罐中生长曲线的测定
使用1.2.5和1.2.6筛选出的最佳培养基组合和最佳培养条件设定发酵参数，在发酵罐中对菌株262AG6进行培养，每隔2 h取样，重复3次，测定发酵液的生物量（OD600），直到其OD600稳定之后停止发酵并放罐，发酵液收集备用。
1.2.8 数据处理
利用Excel和SPSS 22.0等软件处理试验数据。
2 结果与分析
2.1 基础培养基以及碳氮源和无机盐的优化
2.1.1 基础培养基的筛选
试验结果表明（图1），菌株262AG6在B培养基中培养24 h达到最大生物量，其OD600为1.926，在E培养基中的生物量低于B培养基，但差异不显著（P<0.05），从培养基的原料来源和成本控制方面考虑，B培养基（马铃薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）为菌株262AG6的基础培养基。
2.1.2 碳、氮源和无机盐的优化
单因素试验结果表明，生防菌株262AG6在以葡萄糖为碳源时发酵液的吸光值为1.968，显著高于其他组合（P<0.05），玉米淀粉为碳源时发酵液的吸光值最小，说明玉米淀粉不利于262AG6的生长（图2）；以KNO3和NH4Cl為氮源时发酵液OD600分别为2.093和2.070，显著高于其他氮源（P<0.05），但两者差异不显著，由于NH4Cl在高温时易分解，而且KNO3可以通过多种途径得到，因此选择KNO3作为最佳氮源（图3）；以MnSO4和CuSO4为无机盐时262AG6基本不生长，说明Mn.2 和Cu.2 可以抑制菌株262AG6的生长；CaCl2和NaCl为无机盐时发酵液OD600分别为2.49和2.180，显著高于其他处理（P<0.05），而CaCl2和NaCl两者间差异不显著，但由于NaCl比CaCl2更加常见和易得，所以选择NaCl作为最佳无机盐（图4）。
2.2 碳、氮源和无机盐浓度的优化
碳、氮源和无机盐浓度筛选结果表明，葡萄糖浓度为25 g/L时，262AG6的生物量达到最大（图5）；在KNO3和NaCl的浓度分别为14 g/L和15 g/L时（图6～图7），菌株262AG6生物量达到最大，且显著高于其他浓度（P<0.05）。因此确定菌株262AG6的最适碳、氮源和无机盐的浓度分别是25、14和15 g/L。
2.3 正交试验
正交试验对碳、氮源和无机盐浓度优化结果表明，9号处理的生物量显著高于其他处理和CK（P<0.05），其OD600为2.201；因此，菌株262AG6的最适宜碳、氮源和无机盐浓度配比组合为马铃薯200 g，葡萄糖25 g，KNO316 g，NaCl 15 g和水1 000 mL（表2）。 2.4 培养条件的优化
2.4.1 初始pH 的优化
最适pH筛选结果表明（图8），菌株262AG6对pH的适应范围广，在pH5～10的范围内均可生长，其中pH=8时生物量达到最大，OD600为2.176，显著高于其他处理（P<0.05），说明碱性条件更适合菌株生长，在pH小于5和大于10的条件下不能正常生长，说明极端的pH条件可以抑制菌株生长。该结果表明，菌株262AG6生长的最佳pH为8。
2.4.2 温度的优化
试验结果表明（图9），262AG6能够在20～36℃下正常生長，但在34℃时菌株生物量达到最大，OD600为2.49，之后开始下降，说明菌株生长的最适温度为34℃。
2.4.3 装液量和转速的优化
试验结果表明，菌株262AG6发酵的最佳摇瓶装液量为150 mL摇瓶中装液40 mL，其OD600为2.261（图10），装液量过高或过低菌株生物量均低于该值，即150 mL摇瓶的最佳装液量为40 mL；转速在120～240 r/min之间菌株均可以正常生长（图11），在转速为150 r/min时，发酵液的OD600为1.993，显著高于其他转速条件下的生物量，即最佳转速为150 r/min。
2.4.4 接种量的优化
接种量优化结果表明（图12），菌株的生物量在一定范围随接种量的增加而增加，但接种量超过14%之后，生物量的增量不显著，综合考虑将最佳接种量确定为14%。
2.5 菌株生长曲线的测定
在最佳培养基和最优发酵条件下，解淀粉芽胞杆菌262AG6的生物量调整期为4 h，对数期为4～26 h，在26 h处菌株生物量达到最大值，OD600为10.225，之后进入稳定期。
3 结论与讨论
近年来，化学农药的大规模和不合理使用造成了一系列严重的环境以及食品安全方面的问题，而多种微生物特别是芽胞杆菌的代谢产物被证明对病原物具有优良的控制效果，具有开发为生物农药的潜力，且不污染环境，对人畜安全，是化学农药的理想替代品，是未来植物病虫害防治的重要方向，具有极大的研究价值。关于生防微生物的发酵培养国外有较多报道[10-11]，国内报道了红树内生细菌RS261[12]、枯草芽胞杆菌[13]、番茄枯萎病拮抗菌[14]等产抑菌物质的培养基的优化；本试验通过对发酵工艺的优化筛选，菌株262AG6的生物量从优化前的1.926增至10.225，是优化前的5.3倍，效果显著，与车晓曦等[15]、李浩等[16]的研究结果优化发酵条件可以显著提高微生物发酵的菌体量相一致，达到了试验预期的工业化生产条件。
通过前期的研究发现，从东祁连山高寒草地矮生嵩草中分离的内生细菌262AG6对多种病原真菌具有良好的抑制作用[17]，本试验优化了262AG6菌株的发酵培养基和发酵条件，同时通过100 L发酵罐测定其生长曲线，结果表明，解淀粉芽胞杆菌262AG6生长的最适发酵培养基为马铃薯200 g，葡萄糖25 g，KNO3 16 g，NaCl 15 g，水1 000 mL；最佳的培养条件为温度34℃，150 mL摇瓶装液40 mL，振荡器转速150 r/min，培养基初始pH 8，最佳接种量为14%，100 L发酵罐中0～4 h为调整期，4～26 h为其菌株生长的对数期，26 h后菌株生长进入稳定期，因此最佳发酵时间为26 h。该研究结果与张慧等[18]对枯草芽胞杆菌CS16的研究结论相似，但与梁艳琼等[19]对解淀粉芽胞杆菌TWC2的研究结果相比较，除最适发酵条件中温度（34℃）与本试验一致外，其他发酵条件及发酵培养基（5 g/L麦芽糖，10 g/L果糖，10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸出粉，1 g/L CaCl2）均有很大差别，原因可能是262AG6采自东祁连山高寒草地而TWC2采自台湾热带地区，气候上的极大反差使两个菌株的生物学特性有很大差异；与赵晓燕等[20]研究的解淀粉芽胞杆菌XLA03的最佳发酵培养基的碳、氮源为玉米淀粉和豆粕也不同，也可能由菌株间的生物学特性差异所致，从而造成试验结果差异很大。大多数研究认为芽胞杆菌属最佳发酵pH在7左右[3，20-23]，262AG6初始pH为8，与侯美玲等[24]研究得出玉米内生枯草芽胞杆菌的初始pH一致，且pH范围在5～8的条件下生长良好，说明该菌株对碱性条件的耐受度较高，适应范围更广，有更广阔的应用前景；最佳发酵时间为26 h，比魏娇洋等[25]报道的解淀粉芽胞杆菌 X-278的最佳发酵时间为72 h缩短了接近三分之二，最佳接种量14%约为祁之秋等[26]报道的生防菌Hj33-7 30%接种量的一半，说明262AG6对培养条件的要求较低，在发酵过程中可节省成本和时间。解淀粉芽胞杆菌是一种植物根际促生细菌[27]，而秦宇轩等[28]利用固体发酵的方法研究得出解淀粉芽胞杆菌L-H15 能够有效促进植株生长，为该菌株能够更好地在生产应用中提供了有力依据，接下来应利用固体发酵的方法对262AG6进行研究。
参考文献
[1] 韦革宏，杨祥.发酵工程[M].北京：科学出版社，2008.
[2] 傅蕾，李霞，高璐，等.盐胁迫下泛菌属内生细菌对杂交狼尾草发芽及生理的影响[J].草业科学，2017，34（10）：2099-2108.
[3] 刘宁，郭庆港，安海，等.番茄灰霉病生防细菌BAB-1的鉴定及发酵条件的优化[J].中国农业科技导报，2009，11（2）：56-62.
[4] 刘旭，杨晓畅，陶怡，等.葡萄霜霉病拮抗细菌的筛选、鉴定及发酵条件优化[J].果树学报，2015，32（4）：681-688.
[5] 蔡丽，欧燕清，章斌，等.凤凰单丛茶抗菌活性内生细菌FH01发酵条件的优化[J].中国食品添加剂，2016（1）：95-103. [6] 李乔曼，吴亚腾，柳志强，等.催吐萝芙木内生细菌LYM3的分离鉴定及产抗菌活性物质的发酵条件优化[J].广东农业科学，2015（5）：53-57.
[7] 雷白时，张冬冬，王全，等.大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽胞杆菌7-4菌株发酵产抗菌蛋白条件的优化[J].河北农业大学学报，2009，32（4）：60-65.
[8] 方中达.植病研究方法[M].第3版.北京：中国农业出版社，1998：124-125.
[9] 冯中红，畅涛，杨成德，等.一株抗马铃薯坏疽病莫海威芽胞杆菌（Bacillus mojavensis ZA1）培养条件的优化[J].草业学报，2016，25（2）：77-86.
[10]REDDY L V A， YOUNG J W， JONG S Y， et al. Optimization of alkaline protease production by batch culture ofBacillus sp. RKY3 through Plackett-Burman and response surface methodological approaches [J].Bioresource Technology，2008，99：2242-2249.
[11]SONG X J， ZHANG X C， KUANG C H， et al. Optimization of fermentation parameters for the biomass and DHA production ofSchizochytrium limacinum OUC88 using response surface methodology [J].Process Biochemistry，2007，12：1391-1397.
[12]柳凤，卢仕严，刘博凤，等.红树内生细菌RS261抗菌物质的发酵优化和性质分析[J].植物保护，2009，35（5）：70-75.
[13]叶云峰，黎起秦，袁高庆，等.枯草芽胞杆菌B47菌株高产抗菌物质的培养基及发酵条件优化[J].微生物学通报，2011，38（9）：1339-1346.
[14]侯敏，詹发强，张慧涛，等.番茄枯萎病拮抗细菌S13产芽胞发酵培养基及发酵条件优化[J].新疆农业科学，2014，51（7）：1269-1276.
[15]车晓曦，李校堃，李社增.利用响应曲面确定解淀粉芽孢杆菌高发酵产量的区间[J].贵州农业科学，2010，38（5）：110-112.
[16]李浩，任嘉红，叶建仁.响应面法优化生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵工艺[J].生物工程学报，2013，29（2）.243-246.
[17]郭海，杨成德，姚玉玲，等.高寒草地牧草内生细菌262AG6拮抗功能测定及鉴定[J].西北农业学报，2017，26（10）：1529-1536.
[18]张慧，白丹虹，陈济琛，等.枯草芽胞杆菌CS16发酵条件及其抑菌活性物质研究[J].福建农业学报，2015，30（4）：386-393.
[19]梁艳琼，黄兴，吴怀伟，等.解淀粉芽胞杆菌TWC2发酵条件优化[J].中国糖料，2017，39（6）：17-22.
[20]赵晓燕，杨欢，陈建刚，等.一株烟草青枯病生防菌的筛选鉴定及其发酵优化[J].湖北农业科学，2014（8）：1810-1814.
[21]杨良，史应武，娄恺.甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13产抑菌物质培养条件的优化[J].西北农业学报，2012，21（4）：181-186.
[22]车晓曦，李社增，李校堃.1株解淀粉芽胞杆菌发酵培养基的设计及发酵条件的优化[J].安徽农业科学，2010，38（18）：9402-9405.
[23]林天兴，管芩澜，龚明福.内生细菌YBS106菌株发酵条件优化[J].科技资讯，2014，12（6）：140-14143.
[24]候美玲，辛媛媛，郝志敏，等.玉米内生细菌YY1菌株高产抗菌物质的发酵条件优化[J].玉米科学，2012，20（3）：142-147.
[25]魏娇洋，冯龙，李亚宁，等.内生解淀粉芽胞杆菌X-278发酵条件的优化[J].北方园艺，2014（5）：106-110.
[26]祁之秋，李修伟，李兴海，等.辣椒根腐病内生拮抗细菌Hj33-7发酵条件研究[J].沈阳农业大学学报，2010，41（6）：677-680.
[27]COOK R J. Making greater use of introduced microorganisms for biological control of plant pathogens [J].Annual Review of Phytopathology，1993，31：53-80.
[28]秦宇軒，王卉，张志刚，等.解淀粉芽胞杆菌L-H15固态发酵参数优化与试验[J].农业机械学报，2017，48（5）：258-266.
（责任编辑：田 喆）
关键词 矮生嵩草； 解淀粉芽胞杆菌； 发酵培养基； 发酵条件； 优化
中图分类号： TQ 920.6
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2018027
Abstract Bacillus amyloliquefaciens 262AG6 has inhibitory activity against a variety of plant pathogenic fungi. Single-factor and orthogonal experimental design methods were used to optimize the fermentation conditions of this bacterium. The results showed that the optimum fermentation medium included 200 g of potato， 25 g of glucose， 16 g of KNO3， 15 g of NaCl in 1 000 mL of water. The optimal fermentation conditions were as followed： shaking 40 mL liquid （the best inoculum size was 14%） in an 150 mL bottle at 150 r/min at 34℃， with an initial pH value of 9； its growth curve in the 100 L fermenter was composed of 0-6 h for the adjustment period， 6-26 h for the logarithmic phase， and the stable period after 26 h， suggesting a best fermentation time of 26 h.
Key words Kobresia humilis； Bacillus amyloliquefaciens； fermentation medium； fermentation condition； optimization
微生物發酵是指在适宜的条件下，利用微生物将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需产物的过程[1]。微生物发酵工程具有极其强劲的发展动力，在许多学科领域发挥着不可替代的作用，微生物发酵同样是生防微生物从实验室培养研究到工业化生产实践应用过程中必须跨越的台阶。内生细菌作为一种宝贵的天然微生物资源，在宿主防病、杀虫、促生、耐盐及耐干旱等能力提升方面得到了国内外学者的广泛关注[2]，很多植保工作者对生防微生物及其发酵优化进行了研究报道，刘宁等[3]发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilisBAB-1的无菌发酵液在离体叶片上对番茄灰霉病的防治效果达70.92%；刘旭等[4]的研究发现解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciensCS5菌株对葡萄离体叶片上的霜霉病防治效果达96.23%；蔡丽等[5]的研究表明内生细菌FH01的最佳发酵条件为麦芽提取物1.43%（m/v）， 大豆蛋白胨1.67%（m/v）， 初始pH 5.0，发酵温度37℃，摇床转速130 r/min，发酵时间68 h；李乔曼等[6]研究发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis LYM3的发酵上清液具有较高的抗菌活性，通过优化其最适培养基组成为：可溶性淀粉2%、胰蛋白胨1%、酵母粉0.8%、NaCl 1%，初始pH 6.0，28℃，180 r/min，发酵培养60 h，抗菌活性物质产量达到最高；雷白时等[7]对棉花黄萎病菌Verticillium dahliae的拮抗菌多黏芽胞杆菌Bacillus polymyxa7-4产抑菌蛋白的发酵条件进行了优化，发现其最佳培养基组分为：葡萄糖5.0%，大豆蛋白胨5.0%，MgSO4·7H2O 0.10%，MnSO4 0.02%，初始pH 7.5，30℃摇床培养48 h，可以提高对大丽轮枝菌的抑制作用。
解淀粉芽胞杆菌菌株262AG6是本实验室从东祁连山高寒草地矮生嵩草中分离的具有抑菌活性和多种促生功能的优良内生细菌，本试验旨在通过优化其最适发酵培养基和发酵条件，以期为该菌株的工业化生产提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
供试菌株为甘肃农业大学植物保护学院保存的东祁连山高寒草地矮生嵩草内生细菌解淀粉芽胞杆菌262AG6。
1.1.2 供试培养基[8-9]
肉汁胨培养基（NA）用于内生细菌262AG6的活化、保存等。培养基A～G用作基础培养基筛选。A：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL；B：马铃薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL；C：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖8 g，NaCl 5 g，水1 000 mL；D：牛肉膏8 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，水1 000 mL；E：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL；F：玉米淀粉3 g，（NH4）2SO4 10 g，KH2PO4 15 g，蔗糖10 g，水1 000 mL；G：牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，水1 000 mL。 1.1.3 试验仪器设备
BIOF-6100B/S/B/N微生物发酵罐，上海高机生物工程有限公司；紫外/可见光分光光度计，上海洪纪仪器设备有限公司，用于测定发酵液的OD600。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株262AG6的活化和种子液的制备
将保存的262AG6菌株接种于NA培养基上于28℃培养箱中活化，然后接入NA液体培养基中在28℃、180 r/min的条件下过夜培养，制得种子液备用（液体培养基在150 mL的锥形瓶中装液量为50 mL）。
1.2.2 基础培养基的优化
将1.1.2中A～G培养液分装入锥形瓶（40 mL/150 mL），调节pH 为7后灭菌，再接入种子液2 mL，恒温振荡器中振荡培养（28℃，180 r/min），3次重复，培养24 h后通过发酵液的OD600确定生物量，以确定最佳基础培养基。
1.2.3 碳源、氮源和无机盐的优化
用蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、无碳源、葡萄糖分别替换1.2.2筛选出的基础培养基中的碳源，其他同1.2.2，以确定最佳碳源。
用尿素、（NH4）2SO4、KNO3、NH4Cl、酵母膏、不加氮、蛋白胨、牛肉膏分别替换1.2.2筛选出的基础培养基中的氮源，其他同1.2.2，以确定最佳氮源。
用MgSO4、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、CaCl2、不加无机盐离子、NaCl分别替换1.2.2筛选出的基础培养基中的无机盐，其他同1.2.2，以确定最佳无机盐。
1.2.4 最佳碳源、氮源和无机盐浓度的确定
将1.2.3筛选出的最佳碳源分别设置为0、5、10、15、20、25和30g/L、其他同1.2.2，以确定碳源的最适浓度。
将1.2.3筛选出的最佳氮源分别设置为0、4、6、8、10、12、14和16g/L，其他同1.2.2，以确定氮源的最适浓度。
将1.2.3筛选出的最佳无机盐分别设置0、5、10、15、20、25、30、35和40 g/L，其他同1.2.2，以确定无机盐的最适浓度。
1.2.5 碳源、氮源和无机盐的正交试验
根据1.2.3和1.2.4的筛选结果进行L9（3.3）正交试验（表1），28℃，180 r/min条件下培养24 h后测定发酵液的吸光度（OD600），结果经方差检验分析，确定最佳的培养基组合。
1.2.6 摇瓶培养条件优化
设定pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和自然pH，温度为20、24、28、32、34和36℃，恒温振荡器转速为120、150、180、210和240 r/min，摇瓶供氧量设置150 mL锥形瓶培养基装液量为20、40、60、80和100 mL，接种量为2%、6%、10%、14%、18%和22%。利用上述培养条件，在1.2.5最佳培养基组合的基础上，使用单因素试验的方法培养生防菌株262AG6，通过测定发酵液的吸光度（OD600）确定生物量，优化最佳发酵培养条件。
1.2.7 发酵罐中生长曲线的测定
使用1.2.5和1.2.6筛选出的最佳培养基组合和最佳培养条件设定发酵参数，在发酵罐中对菌株262AG6进行培养，每隔2 h取样，重复3次，测定发酵液的生物量（OD600），直到其OD600稳定之后停止发酵并放罐，发酵液收集备用。
1.2.8 数据处理
利用Excel和SPSS 22.0等软件处理试验数据。
2 结果与分析
2.1 基础培养基以及碳氮源和无机盐的优化
2.1.1 基础培养基的筛选
试验结果表明（图1），菌株262AG6在B培养基中培养24 h达到最大生物量，其OD600为1.926，在E培养基中的生物量低于B培养基，但差异不显著（P<0.05），从培养基的原料来源和成本控制方面考虑，B培养基（马铃薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）为菌株262AG6的基础培养基。
2.1.2 碳、氮源和无机盐的优化
单因素试验结果表明，生防菌株262AG6在以葡萄糖为碳源时发酵液的吸光值为1.968，显著高于其他组合（P<0.05），玉米淀粉为碳源时发酵液的吸光值最小，说明玉米淀粉不利于262AG6的生长（图2）；以KNO3和NH4Cl為氮源时发酵液OD600分别为2.093和2.070，显著高于其他氮源（P<0.05），但两者差异不显著，由于NH4Cl在高温时易分解，而且KNO3可以通过多种途径得到，因此选择KNO3作为最佳氮源（图3）；以MnSO4和CuSO4为无机盐时262AG6基本不生长，说明Mn.2 和Cu.2 可以抑制菌株262AG6的生长；CaCl2和NaCl为无机盐时发酵液OD600分别为2.49和2.180，显著高于其他处理（P<0.05），而CaCl2和NaCl两者间差异不显著，但由于NaCl比CaCl2更加常见和易得，所以选择NaCl作为最佳无机盐（图4）。
2.2 碳、氮源和无机盐浓度的优化
碳、氮源和无机盐浓度筛选结果表明，葡萄糖浓度为25 g/L时，262AG6的生物量达到最大（图5）；在KNO3和NaCl的浓度分别为14 g/L和15 g/L时（图6～图7），菌株262AG6生物量达到最大，且显著高于其他浓度（P<0.05）。因此确定菌株262AG6的最适碳、氮源和无机盐的浓度分别是25、14和15 g/L。
2.3 正交试验
正交试验对碳、氮源和无机盐浓度优化结果表明，9号处理的生物量显著高于其他处理和CK（P<0.05），其OD600为2.201；因此，菌株262AG6的最适宜碳、氮源和无机盐浓度配比组合为马铃薯200 g，葡萄糖25 g，KNO316 g，NaCl 15 g和水1 000 mL（表2）。 2.4 培养条件的优化
2.4.1 初始pH 的优化
最适pH筛选结果表明（图8），菌株262AG6对pH的适应范围广，在pH5～10的范围内均可生长，其中pH=8时生物量达到最大，OD600为2.176，显著高于其他处理（P<0.05），说明碱性条件更适合菌株生长，在pH小于5和大于10的条件下不能正常生长，说明极端的pH条件可以抑制菌株生长。该结果表明，菌株262AG6生长的最佳pH为8。
2.4.2 温度的优化
试验结果表明（图9），262AG6能够在20～36℃下正常生長，但在34℃时菌株生物量达到最大，OD600为2.49，之后开始下降，说明菌株生长的最适温度为34℃。
2.4.3 装液量和转速的优化
试验结果表明，菌株262AG6发酵的最佳摇瓶装液量为150 mL摇瓶中装液40 mL，其OD600为2.261（图10），装液量过高或过低菌株生物量均低于该值，即150 mL摇瓶的最佳装液量为40 mL；转速在120～240 r/min之间菌株均可以正常生长（图11），在转速为150 r/min时，发酵液的OD600为1.993，显著高于其他转速条件下的生物量，即最佳转速为150 r/min。
2.4.4 接种量的优化
接种量优化结果表明（图12），菌株的生物量在一定范围随接种量的增加而增加，但接种量超过14%之后，生物量的增量不显著，综合考虑将最佳接种量确定为14%。
2.5 菌株生长曲线的测定
在最佳培养基和最优发酵条件下，解淀粉芽胞杆菌262AG6的生物量调整期为4 h，对数期为4～26 h，在26 h处菌株生物量达到最大值，OD600为10.225，之后进入稳定期。
3 结论与讨论
近年来，化学农药的大规模和不合理使用造成了一系列严重的环境以及食品安全方面的问题，而多种微生物特别是芽胞杆菌的代谢产物被证明对病原物具有优良的控制效果，具有开发为生物农药的潜力，且不污染环境，对人畜安全，是化学农药的理想替代品，是未来植物病虫害防治的重要方向，具有极大的研究价值。关于生防微生物的发酵培养国外有较多报道[10-11]，国内报道了红树内生细菌RS261[12]、枯草芽胞杆菌[13]、番茄枯萎病拮抗菌[14]等产抑菌物质的培养基的优化；本试验通过对发酵工艺的优化筛选，菌株262AG6的生物量从优化前的1.926增至10.225，是优化前的5.3倍，效果显著，与车晓曦等[15]、李浩等[16]的研究结果优化发酵条件可以显著提高微生物发酵的菌体量相一致，达到了试验预期的工业化生产条件。
通过前期的研究发现，从东祁连山高寒草地矮生嵩草中分离的内生细菌262AG6对多种病原真菌具有良好的抑制作用[17]，本试验优化了262AG6菌株的发酵培养基和发酵条件，同时通过100 L发酵罐测定其生长曲线，结果表明，解淀粉芽胞杆菌262AG6生长的最适发酵培养基为马铃薯200 g，葡萄糖25 g，KNO3 16 g，NaCl 15 g，水1 000 mL；最佳的培养条件为温度34℃，150 mL摇瓶装液40 mL，振荡器转速150 r/min，培养基初始pH 8，最佳接种量为14%，100 L发酵罐中0～4 h为调整期，4～26 h为其菌株生长的对数期，26 h后菌株生长进入稳定期，因此最佳发酵时间为26 h。该研究结果与张慧等[18]对枯草芽胞杆菌CS16的研究结论相似，但与梁艳琼等[19]对解淀粉芽胞杆菌TWC2的研究结果相比较，除最适发酵条件中温度（34℃）与本试验一致外，其他发酵条件及发酵培养基（5 g/L麦芽糖，10 g/L果糖，10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸出粉，1 g/L CaCl2）均有很大差别，原因可能是262AG6采自东祁连山高寒草地而TWC2采自台湾热带地区，气候上的极大反差使两个菌株的生物学特性有很大差异；与赵晓燕等[20]研究的解淀粉芽胞杆菌XLA03的最佳发酵培养基的碳、氮源为玉米淀粉和豆粕也不同，也可能由菌株间的生物学特性差异所致，从而造成试验结果差异很大。大多数研究认为芽胞杆菌属最佳发酵pH在7左右[3，20-23]，262AG6初始pH为8，与侯美玲等[24]研究得出玉米内生枯草芽胞杆菌的初始pH一致，且pH范围在5～8的条件下生长良好，说明该菌株对碱性条件的耐受度较高，适应范围更广，有更广阔的应用前景；最佳发酵时间为26 h，比魏娇洋等[25]报道的解淀粉芽胞杆菌 X-278的最佳发酵时间为72 h缩短了接近三分之二，最佳接种量14%约为祁之秋等[26]报道的生防菌Hj33-7 30%接种量的一半，说明262AG6对培养条件的要求较低，在发酵过程中可节省成本和时间。解淀粉芽胞杆菌是一种植物根际促生细菌[27]，而秦宇轩等[28]利用固体发酵的方法研究得出解淀粉芽胞杆菌L-H15 能够有效促进植株生长，为该菌株能够更好地在生产应用中提供了有力依据，接下来应利用固体发酵的方法对262AG6进行研究。
参考文献
[1] 韦革宏，杨祥.发酵工程[M].北京：科学出版社，2008.
[2] 傅蕾，李霞，高璐，等.盐胁迫下泛菌属内生细菌对杂交狼尾草发芽及生理的影响[J].草业科学，2017，34（10）：2099-2108.
[3] 刘宁，郭庆港，安海，等.番茄灰霉病生防细菌BAB-1的鉴定及发酵条件的优化[J].中国农业科技导报，2009，11（2）：56-62.
[4] 刘旭，杨晓畅，陶怡，等.葡萄霜霉病拮抗细菌的筛选、鉴定及发酵条件优化[J].果树学报，2015，32（4）：681-688.
[5] 蔡丽，欧燕清，章斌，等.凤凰单丛茶抗菌活性内生细菌FH01发酵条件的优化[J].中国食品添加剂，2016（1）：95-103. [6] 李乔曼，吴亚腾，柳志强，等.催吐萝芙木内生细菌LYM3的分离鉴定及产抗菌活性物质的发酵条件优化[J].广东农业科学，2015（5）：53-57.
[7] 雷白时，张冬冬，王全，等.大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽胞杆菌7-4菌株发酵产抗菌蛋白条件的优化[J].河北农业大学学报，2009，32（4）：60-65.
[8] 方中达.植病研究方法[M].第3版.北京：中国农业出版社，1998：124-125.
[9] 冯中红，畅涛，杨成德，等.一株抗马铃薯坏疽病莫海威芽胞杆菌（Bacillus mojavensis ZA1）培养条件的优化[J].草业学报，2016，25（2）：77-86.
[10]REDDY L V A， YOUNG J W， JONG S Y， et al. Optimization of alkaline protease production by batch culture ofBacillus sp. RKY3 through Plackett-Burman and response surface methodological approaches [J].Bioresource Technology，2008，99：2242-2249.
[11]SONG X J， ZHANG X C， KUANG C H， et al. Optimization of fermentation parameters for the biomass and DHA production ofSchizochytrium limacinum OUC88 using response surface methodology [J].Process Biochemistry，2007，12：1391-1397.
[12]柳凤，卢仕严，刘博凤，等.红树内生细菌RS261抗菌物质的发酵优化和性质分析[J].植物保护，2009，35（5）：70-75.
[13]叶云峰，黎起秦，袁高庆，等.枯草芽胞杆菌B47菌株高产抗菌物质的培养基及发酵条件优化[J].微生物学通报，2011，38（9）：1339-1346.
[14]侯敏，詹发强，张慧涛，等.番茄枯萎病拮抗细菌S13产芽胞发酵培养基及发酵条件优化[J].新疆农业科学，2014，51（7）：1269-1276.
[15]车晓曦，李校堃，李社增.利用响应曲面确定解淀粉芽孢杆菌高发酵产量的区间[J].贵州农业科学，2010，38（5）：110-112.
[16]李浩，任嘉红，叶建仁.响应面法优化生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵工艺[J].生物工程学报，2013，29（2）.243-246.
[17]郭海，杨成德，姚玉玲，等.高寒草地牧草内生细菌262AG6拮抗功能测定及鉴定[J].西北农业学报，2017，26（10）：1529-1536.
[18]张慧，白丹虹，陈济琛，等.枯草芽胞杆菌CS16发酵条件及其抑菌活性物质研究[J].福建农业学报，2015，30（4）：386-393.
[19]梁艳琼，黄兴，吴怀伟，等.解淀粉芽胞杆菌TWC2发酵条件优化[J].中国糖料，2017，39（6）：17-22.
[20]赵晓燕，杨欢，陈建刚，等.一株烟草青枯病生防菌的筛选鉴定及其发酵优化[J].湖北农业科学，2014（8）：1810-1814.
[21]杨良，史应武，娄恺.甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13产抑菌物质培养条件的优化[J].西北农业学报，2012，21（4）：181-186.
[22]车晓曦，李社增，李校堃.1株解淀粉芽胞杆菌发酵培养基的设计及发酵条件的优化[J].安徽农业科学，2010，38（18）：9402-9405.
[23]林天兴，管芩澜，龚明福.内生细菌YBS106菌株发酵条件优化[J].科技资讯，2014，12（6）：140-14143.
[24]候美玲，辛媛媛，郝志敏，等.玉米内生细菌YY1菌株高产抗菌物质的发酵条件优化[J].玉米科学，2012，20（3）：142-147.
[25]魏娇洋，冯龙，李亚宁，等.内生解淀粉芽胞杆菌X-278发酵条件的优化[J].北方园艺，2014（5）：106-110.
[26]祁之秋，李修伟，李兴海，等.辣椒根腐病内生拮抗细菌Hj33-7发酵条件研究[J].沈阳农业大学学报，2010，41（6）：677-680.
[27]COOK R J. Making greater use of introduced microorganisms for biological control of plant pathogens [J].Annual Review of Phytopathology，1993，31：53-80.
[28]秦宇軒，王卉，张志刚，等.解淀粉芽胞杆菌L-H15固态发酵参数优化与试验[J].农业机械学报，2017，48（5）：258-266.
（责任编辑：田 喆）