【摘 要】
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目的:将一含B结构域缺失的人凝血因子Ⅷ的重组腺病毒载体体外转染SD大鼠脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cell,ADSC),为ADSC联合BDDhFⅧ基因治疗血友病A奠定实验基础
【机 构】
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华北理工大学附属医院血液科,河北唐山063000
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目的:将一含B结构域缺失的人凝血因子Ⅷ的重组腺病毒载体体外转染SD大鼠脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cell,ADSC),为ADSC联合BDDhFⅧ基因治疗血友病A奠定实验基础.方法:取SD大鼠2侧腹股沟脂肪组织分离培养ADSC,传至第3代并进行鉴定;用重组腺病毒载体Ad-BDDhFⅧ-GFP体外感染第3代ADSC,实验分为Ad-BDDhFⅧ-GFP转染ADSC(A组)、Ad-GFP转染ADSC(B组)及未转染ADSC(C组)3组,采用CCK-8法检测3组感染后细胞增殖情况,ELISA法检测细胞上清中hFⅧ抗原表达水平,RT-PCR及Western blot分别检测感染后3组细胞内BDDhFⅧ基因和蛋白表达情况.结果:经鉴定分离培养的第3代细胞生长曲线呈倒“S”形;流式细胞术检测显示,第3代细胞CD29、CD90、CD44表达阳性、CD45表达阴性;经成脂及成骨诱导后可向成骨及成脂方向转化.CCK-8检测显示,转染后3组细胞的增殖未受影响.ELISA结果显示,转染后3组细胞在72 h A组hFⅧAg表达较B、C组明显升高(P＜0.05).RT-PCR结果显示,与A组相比,B、C组未见任何目的条带,无BDDhFⅧ目的基因表达;A组结果与扩增片段长度相符,有BDDhFⅧ目的基因表达.Western blot检测显示,A组hFⅧ蛋白表达水平较B、C组明显升高(P＜0.05).结论:重组腺病毒Ad-BDDhFⅧ-GFP在体外可高效转染大鼠ADSC,为血友病A的基因治疗奠定了实验基础.
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