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背景:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态,但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题。目的:制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层,观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态。设计:多样本观察比较。单位:海南医学院附属医院生殖医学中心。材料:实验于 2006-04/2007-07 在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系 HN-1 由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕 12.5~14.5 d 的胎鼠 11 只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。方法:胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏,按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素 C 处理 2.0~3.0 h 后,按 1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后,按 1∶0,3∶1,1∶1,1∶3,0∶1 比例混合,然后以 1×108 L-1 密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层。观察体外传代培养的人胚胎干细胞在 3种不同饲养层上的生长状态,并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4 表达免疫组化检测、OCT-4 及端粒酶mRNA 表达 RT-PCR 检测。撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况。主要观察指标:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较。③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测。④体外分化实验。结果:①:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按 1∶1 混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按 1:3 混合时无明显变化,优于其余 3 种混合比例。③:碱性磷酸酶染色及 OCT-4 抗原表达均呈强阳性,分别在 200~300 bp 和 300~400 bp 处可见 OCT-4 和端粒酶 mRNA 表达的特异性条带。④:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为 1∶1 时效果较好。