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【摘要】本文分析了研究大熊猫肠道微生态的传统方法，总结概括了可以应用于大熊猫肠道微生态研究的分子生物学方法，并提出只有将分子水平的研究与传统的研究手段结合起来，才能得到更有价值的生物学数据。
【关键词】大熊猫；肠道微生态；分子生物学
0.概述
大熊猫是我国特有的濒危动物，其肠道微生态的研究对保护这一珍稀动物有着极其重要的意义。从已发表的文章来看，关于大熊猫肠道微生态的研究所采用的方法大都比较传统，少有已广泛应用于微生态研究的分子生物学方法。传统的技术是从肠道分离微生物，进一步对其获得的分离物进行表型特征性状的测定和鉴定。由于大多数肠道微生物目前还不能被分离培养 ,所以利用传统的培养方法很难全面地反映肠道菌群的结构特征。而且传统的技术费时耗力，某些特性的测定精确性差，也不能表达分离物间的系统发育关系。
而应用不依赖纯培养的分子生态学方法，可大大扩展对肠道分离物的鉴定能力，解决一些传统的研究方法所不能解决的难题。微生物分子生态学的方法是以微生物群落的总基因组DNA为主要研究对象，通过群落中基因组DNA的种类和相对数量来反映其种类组成特征。因此，对研究大熊猫肠道菌群的生物多样性和深入了解益生菌及其在肠道中的功能有着重大影响。
1.分子生物学方法
随着分子生物学的发展，其新技术已广泛应用于人肠道微生态的研究，而这些技术如果能够在大熊猫肠道微生态的研究中得以应用，将会取得突破性的进展。这些技术主要包括。
1.116SrRNA基因的聚合酶链式反应（简称PCR）[1]
16SrRNA基因序列高度保守，其核苷酸位点的变化具有种的特异性。这种方法的基本过程是，先PCR擴增一模板DNA，然后对扩增片段进行测序。测序后或人工解读，或使用测序数据分析软件包自动解读。测序的正、反链序列经校正后可排列成一个一致序列。例如，将被检分支杆菌的一致序列中的特征性序列和已知分支杆菌的特征性序列进行比较，就可以准确地鉴定这种分支杆菌。或者通过计算机从数据库寻找DNA序列的相似度，当被检分支杆菌的相关序列和数据库的参考序列100%相同时，可以作确切的鉴定。
1.2G+Cmo1％含量的测定[2]
不同细菌DNA有不同G+C含量的平均值，同种细菌菌株间的差异不大于5％，同属间种的差异不超过15％。测定(G+C)mo1％的方法主要为热变性法，其原理为：天然DNA在一定的离子浓度和pH介质中不断加热变性时，随着碱基之间氢键的不断打开，互补双螺旋不断变成单链，导致核酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，当双链完全变成单链后，紫外吸收停止增加，在热变性过程中，紫外吸收增加的中点值所对应的温度为热变性温度(Tm)。Tm值就是通过升高温度使吸光度增加来测定的，细菌DNA中G+C含量越高，其Tm值也较高。用此方法能将不同种的细菌区别开，操作较简单，但分辨力不高，不能对菌株进行区分。
1.3变性梯度凝胶电泳(简称DGGE)和温度梯度凝胶电泳(简称TGGE)
变性梯度凝胶电泳的原理为：在一个引物的5’端加入30－50bp的GC片段，对16SrRNA基因进行PCR反应，把带有较高解链温度GC片段的扩增产物放到有梯度的尿素和甲酰胺作为变性剂的聚炳烯凝胶中进行电泳，部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低；而序列不同的DNA分子的解链速度和程度不同，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使不同序列的DNA分子分开。在恰当的条件下，只要有一个碱基对的差异即可相互分开。温度梯度凝胶电泳也可以分离PCR扩增产物，是近年来发展起来的一种分析大分子的新方法。应用此技术，可以快速地检测超时的单独区系菌群构成，它也可以发现存在的新分离物或供人们利用的益生菌[3]。
1.4脉冲场凝胶电泳（简称PFGE）[4]
脉冲场凝胶电泳实质上是利用电泳脉冲系统通过琼脂糖凝胶迁移很大片段的DNA。方法是用一种少见的限制性内切酶将分离物的基因组消解成相对少的大片段，然后用脉冲场凝胶电泳将它们分开，从而获得DNA片段的指纹图。通过计算机凝胶扫描、软件分析，可以建立对所有微生物的PFGE图谱的数据库，以便各菌株间的比较。PFGE对特异的菌有特征性，步骤简单，具有高分辨力，且结果易于分析。
1.516SrRNA基因的限制性片段长度多态性(简称RFLP)[5]
利用以16SrRNA基因内通常的保守区为靶的引物，用聚合酶链式反应技术扩增16SrRNA基因，用特定的限制性内切酶切割扩增物，再将产生的长短、种类、数目不同的限制性片段，用琼脂糖凝胶电泳分开它们，从而生成一特征性的限制性片段长度多态性。由某一限制性内切酶产生的片段大小和数目在不同个体中即表现出差异。对每一个DNA限制性内切酶组合来说，所产生的片段都是特异性的。RFLP作为检测细菌种内或种间水平的方法，近年来被应用于细菌，尤其是双歧杆菌的分类及鉴定中。
1.6随机扩增多态性技术（简称RAPD）[2]
随机扩增多态性技术的原理为：采用核苷酸序列的随机10—12个碱基的引物对基因组进行DNA扩增，非特异性引物可以结合在模板DNA 的多个位点，产生多个PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳将产物分离开，将每株菌在每条引物下扩增后产生的图谱合成为针对一株菌的单一图谱，再通过软件进行分析，可直接检测DNA多态性的产生，并用于DNA指纹分析。它对于区分亲缘关系近的细菌非常有效。
1.7扩增片段长度多态性分析（简称AFLP）[2]
本方法要求DNA量少，且不须杂交，在实验室内和实验室间重复性均好，可把图谱储存在数据库中，用于先前或今后以及实验室间图谱比较和鉴定新菌株。AFLP分析可用作菌种鉴定和菌株区分(90％-100％同源性为相同株，60％-90％同源性为同种不同株，40％-60％ 同源性为同属不同种，<40％为不同属)。AFLP分析具有与RFLP，RAPD等相同的分类学范围，并兼有这些技术的优点，在多数情况下有最高的分辨力。
1.8荧光原位杂交（简称FISH）和荧光显微技术
荧光原位杂交和荧光显微技术是在单细胞水平上分析微生物群落结构的一种方法，使用该技术可进行单个细胞的快速分类[6]。此技术是将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片上的细胞进行杂交，固定过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸，用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞。有人认为，可以应用荧光原位杂交和荧光显微技术测定自然区系中菌类生长的速率，从而了解特异微生物类群在生物群体中的空间分布特征。
2.小结
技术的进步必将促进科学研究的发展，分子生物学技术将在大熊猫肠道微生态的研究中发挥越来越大的作用，将把大熊猫肠道微生态的研究工作带入一个崭新的阶段。然而，只有将分子水平的研究与传统的研究手段结合起来，才能得到更有价值的生物学数据。■
【参考文献】
［１］刘佳文，吕红艳．国外医学临床生物化学与检验学分册，2001，22(5)：265-268.
［２］幺山山，曾明.微生态细菌的遗传学分类方法研究进展[J].微生物学免疫学进展，2003，31(2)：75-78.
［３］龙跃洲，李伟．一种分析大分子结构的新方法一TGGE STSTEM[J]．国外医学：遗传学分册，2003，26(1)：10-13．
［４］Guarner F． Malagelada J．R．The Loalost，2003；360：5l2-519.
［５］陆德如，陈永青编著．基因工程．北京：化学工业出版社，2002：27-29.
［６］余利岩，姚天爵．Actinobacteria的分离与鉴定[J]．微生物学通报，2001，28(1)：89-92．
【关键词】大熊猫；肠道微生态；分子生物学
0.概述
大熊猫是我国特有的濒危动物，其肠道微生态的研究对保护这一珍稀动物有着极其重要的意义。从已发表的文章来看，关于大熊猫肠道微生态的研究所采用的方法大都比较传统，少有已广泛应用于微生态研究的分子生物学方法。传统的技术是从肠道分离微生物，进一步对其获得的分离物进行表型特征性状的测定和鉴定。由于大多数肠道微生物目前还不能被分离培养 ,所以利用传统的培养方法很难全面地反映肠道菌群的结构特征。而且传统的技术费时耗力，某些特性的测定精确性差，也不能表达分离物间的系统发育关系。
而应用不依赖纯培养的分子生态学方法，可大大扩展对肠道分离物的鉴定能力，解决一些传统的研究方法所不能解决的难题。微生物分子生态学的方法是以微生物群落的总基因组DNA为主要研究对象，通过群落中基因组DNA的种类和相对数量来反映其种类组成特征。因此，对研究大熊猫肠道菌群的生物多样性和深入了解益生菌及其在肠道中的功能有着重大影响。
1.分子生物学方法
随着分子生物学的发展，其新技术已广泛应用于人肠道微生态的研究，而这些技术如果能够在大熊猫肠道微生态的研究中得以应用，将会取得突破性的进展。这些技术主要包括。
1.116SrRNA基因的聚合酶链式反应（简称PCR）[1]
16SrRNA基因序列高度保守，其核苷酸位点的变化具有种的特异性。这种方法的基本过程是，先PCR擴增一模板DNA，然后对扩增片段进行测序。测序后或人工解读，或使用测序数据分析软件包自动解读。测序的正、反链序列经校正后可排列成一个一致序列。例如，将被检分支杆菌的一致序列中的特征性序列和已知分支杆菌的特征性序列进行比较，就可以准确地鉴定这种分支杆菌。或者通过计算机从数据库寻找DNA序列的相似度，当被检分支杆菌的相关序列和数据库的参考序列100%相同时，可以作确切的鉴定。
1.2G+Cmo1％含量的测定[2]
不同细菌DNA有不同G+C含量的平均值，同种细菌菌株间的差异不大于5％，同属间种的差异不超过15％。测定(G+C)mo1％的方法主要为热变性法，其原理为：天然DNA在一定的离子浓度和pH介质中不断加热变性时，随着碱基之间氢键的不断打开，互补双螺旋不断变成单链，导致核酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，当双链完全变成单链后，紫外吸收停止增加，在热变性过程中，紫外吸收增加的中点值所对应的温度为热变性温度(Tm)。Tm值就是通过升高温度使吸光度增加来测定的，细菌DNA中G+C含量越高，其Tm值也较高。用此方法能将不同种的细菌区别开，操作较简单，但分辨力不高，不能对菌株进行区分。
1.3变性梯度凝胶电泳(简称DGGE)和温度梯度凝胶电泳(简称TGGE)
变性梯度凝胶电泳的原理为：在一个引物的5’端加入30－50bp的GC片段，对16SrRNA基因进行PCR反应，把带有较高解链温度GC片段的扩增产物放到有梯度的尿素和甲酰胺作为变性剂的聚炳烯凝胶中进行电泳，部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低；而序列不同的DNA分子的解链速度和程度不同，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使不同序列的DNA分子分开。在恰当的条件下，只要有一个碱基对的差异即可相互分开。温度梯度凝胶电泳也可以分离PCR扩增产物，是近年来发展起来的一种分析大分子的新方法。应用此技术，可以快速地检测超时的单独区系菌群构成，它也可以发现存在的新分离物或供人们利用的益生菌[3]。
1.4脉冲场凝胶电泳（简称PFGE）[4]
脉冲场凝胶电泳实质上是利用电泳脉冲系统通过琼脂糖凝胶迁移很大片段的DNA。方法是用一种少见的限制性内切酶将分离物的基因组消解成相对少的大片段，然后用脉冲场凝胶电泳将它们分开，从而获得DNA片段的指纹图。通过计算机凝胶扫描、软件分析，可以建立对所有微生物的PFGE图谱的数据库，以便各菌株间的比较。PFGE对特异的菌有特征性，步骤简单，具有高分辨力，且结果易于分析。
1.516SrRNA基因的限制性片段长度多态性(简称RFLP)[5]
利用以16SrRNA基因内通常的保守区为靶的引物，用聚合酶链式反应技术扩增16SrRNA基因，用特定的限制性内切酶切割扩增物，再将产生的长短、种类、数目不同的限制性片段，用琼脂糖凝胶电泳分开它们，从而生成一特征性的限制性片段长度多态性。由某一限制性内切酶产生的片段大小和数目在不同个体中即表现出差异。对每一个DNA限制性内切酶组合来说，所产生的片段都是特异性的。RFLP作为检测细菌种内或种间水平的方法，近年来被应用于细菌，尤其是双歧杆菌的分类及鉴定中。
1.6随机扩增多态性技术（简称RAPD）[2]
随机扩增多态性技术的原理为：采用核苷酸序列的随机10—12个碱基的引物对基因组进行DNA扩增，非特异性引物可以结合在模板DNA 的多个位点，产生多个PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳将产物分离开，将每株菌在每条引物下扩增后产生的图谱合成为针对一株菌的单一图谱，再通过软件进行分析，可直接检测DNA多态性的产生，并用于DNA指纹分析。它对于区分亲缘关系近的细菌非常有效。
1.7扩增片段长度多态性分析（简称AFLP）[2]
本方法要求DNA量少，且不须杂交，在实验室内和实验室间重复性均好，可把图谱储存在数据库中，用于先前或今后以及实验室间图谱比较和鉴定新菌株。AFLP分析可用作菌种鉴定和菌株区分(90％-100％同源性为相同株，60％-90％同源性为同种不同株，40％-60％ 同源性为同属不同种，<40％为不同属)。AFLP分析具有与RFLP，RAPD等相同的分类学范围，并兼有这些技术的优点，在多数情况下有最高的分辨力。
1.8荧光原位杂交（简称FISH）和荧光显微技术
荧光原位杂交和荧光显微技术是在单细胞水平上分析微生物群落结构的一种方法，使用该技术可进行单个细胞的快速分类[6]。此技术是将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片上的细胞进行杂交，固定过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸，用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞。有人认为，可以应用荧光原位杂交和荧光显微技术测定自然区系中菌类生长的速率，从而了解特异微生物类群在生物群体中的空间分布特征。
2.小结
技术的进步必将促进科学研究的发展，分子生物学技术将在大熊猫肠道微生态的研究中发挥越来越大的作用，将把大熊猫肠道微生态的研究工作带入一个崭新的阶段。然而，只有将分子水平的研究与传统的研究手段结合起来，才能得到更有价值的生物学数据。■
【参考文献】
［１］刘佳文，吕红艳．国外医学临床生物化学与检验学分册，2001，22(5)：265-268.
［２］幺山山，曾明.微生态细菌的遗传学分类方法研究进展[J].微生物学免疫学进展，2003，31(2)：75-78.
［３］龙跃洲，李伟．一种分析大分子结构的新方法一TGGE STSTEM[J]．国外医学：遗传学分册，2003，26(1)：10-13．
［４］Guarner F． Malagelada J．R．The Loalost，2003；360：5l2-519.
［５］陆德如，陈永青编著．基因工程．北京：化学工业出版社，2002：27-29.
［６］余利岩，姚天爵．Actinobacteria的分离与鉴定[J]．微生物学通报，2001，28(1)：89-92．