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[摘要] 目的 探讨白藜芦醇对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠MMP-9及TIMP-1的影响。 方法 选择健康7日龄新生Wistar大鼠 112只，分为三组：假手术组（n=36只）、缺氧组（n=38只）、HIBD 白藜芦醇药物干预组（n=38只），各组再分为6 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d时间段进行检测。比较各组不同时间点 MMP-9、TIMP-1的表达。 结果HIBD组的MMP-9水平治疗6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分别显著高于假手术组，但经RES干预后，HIBD RES组的MMP-9水平分别显著低于HIBD组（P<0.05），但仍显著高于假手术组。 结论 RES能够抑制MMP-9的表达，从而使伴随MMP-9病理性表达升高的TIMP-1也相应减少，而调节MMP-9/TIMP-1的平衡，可能是其在HIBD中发挥神经保护作用的机制之一。
[关键词] 缺氧缺血性脑损伤；新生大鼠；白藜芦醇；MMP-9；TIMP-1
[中图分类号] R722.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）09-0006-02
The impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats
MEI Mei1 WANG Xianhe1 SUN Huawei2
1.Department of Pediatric，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002，China； 2.Department of Radiotherapy，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China
[Abstract] Objective To investigate the impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats. Methods Selected healthy 7 day old newborn Wistar rats 112 rats，were divided into three groups： sham operation group （n=36）， hypoxia group （n=38 only）， HIBD resveratrol drug intervention group （n=38）， each group was tested at 6 h， 24 h， 48 h， 72 h， 5 d and 7 d. The expression of TIMP-1 and MMP-9 Groups were compared at different time points. Results The MMP-9 level of 6 h， 24 h， 48 h，72 h， 5 d， 7 d in HIBD group， were significantly higher than those in the sham operation group，and was significantly higher than that of RES， but the MMP-9 levels in intervention group HIBD RES were significantly lower than those in HIBD group（P<0.05）， but still significantly higher than those in the shamoperation group. Conclusion The expression of RES can inhibit MMP-9， so with MMP-9 diseaseand rational expression of elevated TIMP-1 also reduce， and regulate the balance of MMP-9/TIMP-1， may be the one of the nerve protection mechanism in HIBD.
[Key words] Hypoxic ischemic brain damage； Neonatal rat； Resveratrol； MMP-9； TIMP-1
新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是导致小儿智能低下和脑性瘫痪的重要原因。脑水肿是其最常见的病理改变，包括早期细胞毒性水肿和血脑屏障（BBB）损伤引起的血管源性脑水肿（VBE）。近年来研究证实，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）与急性期BBB的损伤密切相关，进而导致VBE的形成，而MMP-9的活性又受其金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）的特异性抑制[1]。近年来研究发现，通过药物抑制MMP-9在HIBD中的表达以减轻脑水肿，可能为治疗缺氧缺血性脑病拓展新思路。白藜芦醇（resveratrol，RES）是来源于植物中的一种脂溶性天然植物抗毒素，研究证实，其具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗癌、抗氧化、心血管保护等作用[2，3]。本研究旨在探讨白藜芦醇对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠MMP-9及TIMP-1的影响，从而为中枢神经系统的保护机制研究提供进一步的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源
健康7日龄新生Wistar大鼠 112只，购于佳木斯大学实验动物中心。纳入标准：精神活泼，反应灵敏，体形正常。排除标准：未达到上述年龄标准；精神萎靡，反应迟钝；有感染及其他不健康症状；行走不稳。将112只Wistar大鼠分为三组：假手术组（n=36只）：手术分离颈总动脉后不结扎，缝合手术切口后，不放入氧仓做低氧处理；缺氧组（n=38只）：单纯做缺氧缺血性脑病（HIBD）模型；HIBD 白藜芦醇药物干预组（n=38只）：HIBD模型制作后每天腹腔注射2%的RES药液，按50 μg/g，1次/d。各组分为6 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d 个时间段进行检测。 1.2方法
1.2.1 建立HIE动物模型 取新生7日龄Wistar大鼠。取颈正中1 cm左右纵形切口，在左侧胸锁乳突肌深面与气管之间找到并游离左侧颈总动脉，暴露左颈总动脉，用5-0号丝线结扎双线结扎后剪断左侧颈总动脉。以（1～2）L/min的速度，持续输入含8%氧气和92%氮气的混合气体，以CY-12C测氧仪监控氧浓度为（8±0.5）%，低氧2 h后将新生鼠取出，返回母鼠身边继续喂哺以备用。同时假手术组（仅做颈正中切口，游离左侧颈总动脉，但不结扎）亦不做低氧处理。
1.2.2 药物配制及干预治疗 无菌操作下先用医用酒精溶解RES，再用生理盐水稀释浓度为2%的溶液，-20℃冰箱保存。造模成功后药物干预组乳鼠按50 μg/g，腹腔注射给药，1次/d。缺氧组乳鼠则同时给予上述标准等量生理盐水腹腔注射。至各不同时间点处死取材。
1.2.3 取材及切片的制作 三组大鼠分别于缺氧缺血后6 h、12 h、24 h、72 h、5 d和7 d处死。断头取脑，以视交叉为切点，冠状位向后取一片约厚3 mm组织。标本按常规给予甲醛固定。用石蜡切片机做连续冠状切片，置于经多聚-L-赖氨酸处理的防脱载玻片上，片厚5 μm。
1.2.4 免疫组织化学染色检测MMP-9、TIMP-1的表达 选用SP即用型免疫组化试剂盒进行免疫染色，DAB显色。所有步骤参照试剂盒说明书进行。设置对照：取相同量的PBS代替一抗MMP-9和TIMP-l，其余步骤同前。
1.3 阳性细胞的判断[4]
MMP-9、TIMP-1阳性着色表现为胞浆染成浅黄色棕黄色或棕褐色。采用阳性细胞计数法，每张切片在400倍物镜下分别随机选取不重复的6个视野，计数MMP-9、TIMP-1阳性细胞数，取平均值，以均数±标准差表示。
1.4 统计学处理
应用SPSS12.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较使用t检验或进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
见表1、2。HIBD组的MMP-9水平、TIMP-1水平治疗6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分别显著高于假手术组，但经RES干预后，HIBD RES组的MMP-9水平显著低于HIBD组（P<0.05），但仍显著高于假手术组。
3讨论
MMPs是降解ECM、同时又是阻止ECM对血管内皮细胞修复作用的主要蛋白酶，参与胚胎正常发育及组织重塑，并在多种病理过程中发挥作用[5]。近研究表明，脑缺氧缺血后出现MMP-9的合成上调，MMP-9与BBB的破坏、继发性炎性反应和VBE等密切相关[6]。研究显示[7]在局灶性脑缺血再灌注小白鼠模型实验中发现，活化的MMP-9的早期出现导致BBB破坏和VBE。而MMPs的表达可经多种机制调控发生：转录水平、酶原激活水平和TIMPs的调节。
TIMP-1由巨嗜细胞、角质生产细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成，能抑制绝大多数MMPs，己经证实TIMP-1优先与MMP-9特异性结合，形成可溶性非共价复合物而发挥其抑制作用[8]。且研究发现，TIMPs不仅是MMPs的抑制剂，可能还在MMPs的激活级联过程中扮演重要角色[9]。
国内对于MMP-9、TIMP-1在参与缺血性脑血管病变后BBB损害、VBE的形成过程中的变化规律及相互关系研究甚少；对于MMP-9在脑缺血再灌注损伤过程中其非特异性抑制剂干预方面的研究文献也很少见。
RES是一种发现于多种食用植物和红葡萄酒的天然化合物，具有抗氧化活性、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、雌激素样活性、生长抑制活性、免疫调节以及化学预防作用、诱导细胞凋亡及抗肿瘤活性等[10]。近年针对RES神经保护性作用的研究也成为近年来神经科学领域里的一个研究热点。本实验结果显示，HIBD组的MMP-9水平治疗6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分别显著高于假手术组，但经RES干预后，HIBD RES组的MMP-9水平分别显著低于HIBD组（P<0.05），但仍显著高于假手术组，证实RES不但可抑制MMP-9的表达，并使与其伴随升高的TIMP-1的表达也相应减少，尤其是在VBE发生的高峰时期24～48 h间，RES可明显减少MMP-9的表达，从而降低了TIMP-1的病理性表达增强的反应，而调节MMP-9/TIMP-1的平衡，从而减轻脑水肿发挥脑保护的作用[11]。
综上，我们得出，RES能够抑制MMP-9的表达，从而使伴随MMP-9病理性表达升高的TIMP-1也相应减少，而调节MMP-9/TIMP-1的平衡，可能是其在HIBD中发挥神经保护作用的机制之一。
[参考文献]
[1] Celotti E，Ferrarini R，Zironi R，et al. Resveratrol content of some wines obtained from dried Valpolicella grapes：Recioto and amaron[J]. J Chromatogr A，1996，730（1-2）：47-52.
[2] 王姗姗，李章平，陈寿权. MMPs与血脑屏障的关系[J]. 国外医学·生理、病理学与临床分册，2006，25（2）：185-188.
[3] Chung TW，Lee YC，Kim CH，Hepatitis B viral HBX induces matrix metalloproteinases-9 gene expression through activation of ERK and PI-3/AKT pathways：Involvement of invasive potential[J]. FASEB J，2004，18（10）：1123-1125. [4] Lee SR，Lo EH. Induction of caspase-mediated cell death by matrix metalloproteinases in cerebral endothelial cells after hypoxia-reoxygenation[J]. J Cereb Blood Flow Mletab，2004，24（7）：720-727.
[5] 邓学军，孙圣刚，梅元武. 白黎芦醇保护脑海马区缺血神经元的机制探讨[J]. 现代康复，2001，5（7）：52-53.
[6] 田雪梅，张展霞. 白黎芦醇促进Ca2 介导的线粒体通透转变孔道开放[J]. 药学学报，2003，38（2）：81-84.
[7] 张微微，魏亚洲，周小英. 大鼠脑缺血/再灌注层粘连蛋白表达的实验研究[J]. 北京医学，2005，27（7）：408-410.
[8] Svedin P，Hagberg H，Savman K，et al. Matrix metalloproteinase-9 gene knock-out protects the immature brain after cerebral hypoxia-ischemia[J]. J Neurosci，2007，27（7）：1511-1518.
[9] Cunningham LA，Wetzel M，Rosenberg GA. Multiple roles for MMPs and TIMPs in cerebral ischemia[J]. Glia，2005， 50（4）：329-339.
[10] 周杰，章翔，蒋晓帆，等. 白藜芦醇对大鼠创伤性脑水肿的影响及超微结构观察[J]. 西北国防医学杂志，2006， 27（2）：116-118，封三.
[11] Yushchenko M，Mader M，Elitok E，et al. Interferon-beta-1b decreased matrix metalloproteinase-9 serum levels in primary progressive multiple sclerosis[J]. J Neurol，2003，250（10）：1224-1228.
（收稿日期：2015-02-02）
[关键词] 缺氧缺血性脑损伤；新生大鼠；白藜芦醇；MMP-9；TIMP-1
[中图分类号] R722.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）09-0006-02
The impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats
MEI Mei1 WANG Xianhe1 SUN Huawei2
1.Department of Pediatric，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002，China； 2.Department of Radiotherapy，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China
[Abstract] Objective To investigate the impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats. Methods Selected healthy 7 day old newborn Wistar rats 112 rats，were divided into three groups： sham operation group （n=36）， hypoxia group （n=38 only）， HIBD resveratrol drug intervention group （n=38）， each group was tested at 6 h， 24 h， 48 h， 72 h， 5 d and 7 d. The expression of TIMP-1 and MMP-9 Groups were compared at different time points. Results The MMP-9 level of 6 h， 24 h， 48 h，72 h， 5 d， 7 d in HIBD group， were significantly higher than those in the sham operation group，and was significantly higher than that of RES， but the MMP-9 levels in intervention group HIBD RES were significantly lower than those in HIBD group（P<0.05）， but still significantly higher than those in the shamoperation group. Conclusion The expression of RES can inhibit MMP-9， so with MMP-9 diseaseand rational expression of elevated TIMP-1 also reduce， and regulate the balance of MMP-9/TIMP-1， may be the one of the nerve protection mechanism in HIBD.
[Key words] Hypoxic ischemic brain damage； Neonatal rat； Resveratrol； MMP-9； TIMP-1
新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是导致小儿智能低下和脑性瘫痪的重要原因。脑水肿是其最常见的病理改变，包括早期细胞毒性水肿和血脑屏障（BBB）损伤引起的血管源性脑水肿（VBE）。近年来研究证实，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）与急性期BBB的损伤密切相关，进而导致VBE的形成，而MMP-9的活性又受其金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）的特异性抑制[1]。近年来研究发现，通过药物抑制MMP-9在HIBD中的表达以减轻脑水肿，可能为治疗缺氧缺血性脑病拓展新思路。白藜芦醇（resveratrol，RES）是来源于植物中的一种脂溶性天然植物抗毒素，研究证实，其具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗癌、抗氧化、心血管保护等作用[2，3]。本研究旨在探讨白藜芦醇对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠MMP-9及TIMP-1的影响，从而为中枢神经系统的保护机制研究提供进一步的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源
健康7日龄新生Wistar大鼠 112只，购于佳木斯大学实验动物中心。纳入标准：精神活泼，反应灵敏，体形正常。排除标准：未达到上述年龄标准；精神萎靡，反应迟钝；有感染及其他不健康症状；行走不稳。将112只Wistar大鼠分为三组：假手术组（n=36只）：手术分离颈总动脉后不结扎，缝合手术切口后，不放入氧仓做低氧处理；缺氧组（n=38只）：单纯做缺氧缺血性脑病（HIBD）模型；HIBD 白藜芦醇药物干预组（n=38只）：HIBD模型制作后每天腹腔注射2%的RES药液，按50 μg/g，1次/d。各组分为6 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d 个时间段进行检测。 1.2方法
1.2.1 建立HIE动物模型 取新生7日龄Wistar大鼠。取颈正中1 cm左右纵形切口，在左侧胸锁乳突肌深面与气管之间找到并游离左侧颈总动脉，暴露左颈总动脉，用5-0号丝线结扎双线结扎后剪断左侧颈总动脉。以（1～2）L/min的速度，持续输入含8%氧气和92%氮气的混合气体，以CY-12C测氧仪监控氧浓度为（8±0.5）%，低氧2 h后将新生鼠取出，返回母鼠身边继续喂哺以备用。同时假手术组（仅做颈正中切口，游离左侧颈总动脉，但不结扎）亦不做低氧处理。
1.2.2 药物配制及干预治疗 无菌操作下先用医用酒精溶解RES，再用生理盐水稀释浓度为2%的溶液，-20℃冰箱保存。造模成功后药物干预组乳鼠按50 μg/g，腹腔注射给药，1次/d。缺氧组乳鼠则同时给予上述标准等量生理盐水腹腔注射。至各不同时间点处死取材。
1.2.3 取材及切片的制作 三组大鼠分别于缺氧缺血后6 h、12 h、24 h、72 h、5 d和7 d处死。断头取脑，以视交叉为切点，冠状位向后取一片约厚3 mm组织。标本按常规给予甲醛固定。用石蜡切片机做连续冠状切片，置于经多聚-L-赖氨酸处理的防脱载玻片上，片厚5 μm。
1.2.4 免疫组织化学染色检测MMP-9、TIMP-1的表达 选用SP即用型免疫组化试剂盒进行免疫染色，DAB显色。所有步骤参照试剂盒说明书进行。设置对照：取相同量的PBS代替一抗MMP-9和TIMP-l，其余步骤同前。
1.3 阳性细胞的判断[4]
MMP-9、TIMP-1阳性着色表现为胞浆染成浅黄色棕黄色或棕褐色。采用阳性细胞计数法，每张切片在400倍物镜下分别随机选取不重复的6个视野，计数MMP-9、TIMP-1阳性细胞数，取平均值，以均数±标准差表示。
1.4 统计学处理
应用SPSS12.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较使用t检验或进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
见表1、2。HIBD组的MMP-9水平、TIMP-1水平治疗6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分别显著高于假手术组，但经RES干预后，HIBD RES组的MMP-9水平显著低于HIBD组（P<0.05），但仍显著高于假手术组。
3讨论
MMPs是降解ECM、同时又是阻止ECM对血管内皮细胞修复作用的主要蛋白酶，参与胚胎正常发育及组织重塑，并在多种病理过程中发挥作用[5]。近研究表明，脑缺氧缺血后出现MMP-9的合成上调，MMP-9与BBB的破坏、继发性炎性反应和VBE等密切相关[6]。研究显示[7]在局灶性脑缺血再灌注小白鼠模型实验中发现，活化的MMP-9的早期出现导致BBB破坏和VBE。而MMPs的表达可经多种机制调控发生：转录水平、酶原激活水平和TIMPs的调节。
TIMP-1由巨嗜细胞、角质生产细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成，能抑制绝大多数MMPs，己经证实TIMP-1优先与MMP-9特异性结合，形成可溶性非共价复合物而发挥其抑制作用[8]。且研究发现，TIMPs不仅是MMPs的抑制剂，可能还在MMPs的激活级联过程中扮演重要角色[9]。
国内对于MMP-9、TIMP-1在参与缺血性脑血管病变后BBB损害、VBE的形成过程中的变化规律及相互关系研究甚少；对于MMP-9在脑缺血再灌注损伤过程中其非特异性抑制剂干预方面的研究文献也很少见。
RES是一种发现于多种食用植物和红葡萄酒的天然化合物，具有抗氧化活性、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、雌激素样活性、生长抑制活性、免疫调节以及化学预防作用、诱导细胞凋亡及抗肿瘤活性等[10]。近年针对RES神经保护性作用的研究也成为近年来神经科学领域里的一个研究热点。本实验结果显示，HIBD组的MMP-9水平治疗6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分别显著高于假手术组，但经RES干预后，HIBD RES组的MMP-9水平分别显著低于HIBD组（P<0.05），但仍显著高于假手术组，证实RES不但可抑制MMP-9的表达，并使与其伴随升高的TIMP-1的表达也相应减少，尤其是在VBE发生的高峰时期24～48 h间，RES可明显减少MMP-9的表达，从而降低了TIMP-1的病理性表达增强的反应，而调节MMP-9/TIMP-1的平衡，从而减轻脑水肿发挥脑保护的作用[11]。
综上，我们得出，RES能够抑制MMP-9的表达，从而使伴随MMP-9病理性表达升高的TIMP-1也相应减少，而调节MMP-9/TIMP-1的平衡，可能是其在HIBD中发挥神经保护作用的机制之一。
[参考文献]
[1] Celotti E，Ferrarini R，Zironi R，et al. Resveratrol content of some wines obtained from dried Valpolicella grapes：Recioto and amaron[J]. J Chromatogr A，1996，730（1-2）：47-52.
[2] 王姗姗，李章平，陈寿权. MMPs与血脑屏障的关系[J]. 国外医学·生理、病理学与临床分册，2006，25（2）：185-188.
[3] Chung TW，Lee YC，Kim CH，Hepatitis B viral HBX induces matrix metalloproteinases-9 gene expression through activation of ERK and PI-3/AKT pathways：Involvement of invasive potential[J]. FASEB J，2004，18（10）：1123-1125. [4] Lee SR，Lo EH. Induction of caspase-mediated cell death by matrix metalloproteinases in cerebral endothelial cells after hypoxia-reoxygenation[J]. J Cereb Blood Flow Mletab，2004，24（7）：720-727.
[5] 邓学军，孙圣刚，梅元武. 白黎芦醇保护脑海马区缺血神经元的机制探讨[J]. 现代康复，2001，5（7）：52-53.
[6] 田雪梅，张展霞. 白黎芦醇促进Ca2 介导的线粒体通透转变孔道开放[J]. 药学学报，2003，38（2）：81-84.
[7] 张微微，魏亚洲，周小英. 大鼠脑缺血/再灌注层粘连蛋白表达的实验研究[J]. 北京医学，2005，27（7）：408-410.
[8] Svedin P，Hagberg H，Savman K，et al. Matrix metalloproteinase-9 gene knock-out protects the immature brain after cerebral hypoxia-ischemia[J]. J Neurosci，2007，27（7）：1511-1518.
[9] Cunningham LA，Wetzel M，Rosenberg GA. Multiple roles for MMPs and TIMPs in cerebral ischemia[J]. Glia，2005， 50（4）：329-339.
[10] 周杰，章翔，蒋晓帆，等. 白藜芦醇对大鼠创伤性脑水肿的影响及超微结构观察[J]. 西北国防医学杂志，2006， 27（2）：116-118，封三.
[11] Yushchenko M，Mader M，Elitok E，et al. Interferon-beta-1b decreased matrix metalloproteinase-9 serum levels in primary progressive multiple sclerosis[J]. J Neurol，2003，250（10）：1224-1228.
（收稿日期：2015-02-02）