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【摘 要】 目的：通过癸壬化石丸对大鼠亚急性毒性实验研究评价其安全性，为新药开发和临床安全用药提供实验依据。方法：将20只SD大鼠随机分为对照组和实验组，对照组用50%吐温80+生理盐水灌胃3mL/（次·d）；实验组将癸壬化石丸浸膏+50%吐温80+生理盐水配置成浓度05g/mL混悬液（相当于生药浓度285g/mL），灌胃3mL/（次·d），连续给药14d。观察大鼠一般情况（血尿、大便、活动度、体重、进食量及死亡）；血液生化检测ALT、AST、AST/ALT、Urea；大体解剖观察心、肺、肝、肾外观有无异常；HE染色光镜下观察肝、肾组织有无病理改变。结果：实验组与对照组一般情况比较：均无血尿，活动度、大便性状无异常，进食量呈同步变化，体重变化差异无统计学意义（P>005）；血液生化各项指标比较差异无统计学意义（P>005）；肉眼观察两组大鼠心、肺、肝、肾无异常改变；光镜观察实验组仅见肝细胞轻度水肿；肾小管上皮轻度水肿，局灶可见空泡变性，间质少量淋巴细胞浸润。结论：在本实验条件下，癸壬化石丸无明显的亚急性毒性，安全性较高。
【关键词】 癸壬化石丸；大鼠；肾结石；亚急性毒性
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）23-0046-03
肾结石是泌尿系统常见病，发病率在15%左右，尤其是中国川南地区发病率极高[1]，且采用手术治疗术后再发率高达50%左右[2-3]。西药枸橼酸盐、镁制剂、磷酸盐、乙酰半胱氨酸等对结石直径>06cm的患者效果不明显，且副作用较大。癸壬化石丸治疗肾结石在川南地区经较长时间应用，临床效果显著，拟开发为国家新药。前期试验研究结果表明[4]，癸壬化石丸对大鼠的急性毒性经口LD50>500g/kg，按急性毒性分级标准规定，该受试物为无毒级。本研究进行大鼠的亚急性毒性试验，旨在进一步探讨癸壬化石丸的毒性作用，对其安全性进行评价，为临床提供理论依据。
1 材料与方法
11 材料
111 实验动物 SPF级SD大鼠20只，体重（200±20）g，雌雄各半，西南医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）2013-17。
112 药物 生理盐水（批号：15042343，美大康佳乐药业）；5%吐温80 （批号：080928，成都金山化学试剂）；癸壬化石丸浸膏（西南医科大附属中医院制备）；戊巴比妥钠（批号：F20050405，上海化学）。
12 方法 前期采用限量实验，癸壬化石丸对大鼠的急性毒性经口LD50>500g/kg，按急性毒性分级标准规定，该受试物为无毒级。对照组用50%吐温80+生理盐水灌胃3mL/（次·d），连续14d。实验组用癸壬化石丸最大使用浓度灌胃，即癸壬化石丸浸膏+50%吐温80+生理盐水配置成05g/mL混悬液（相当于生药浓度285g/mL）灌胃3mL/（次·d），连续14d。每次癸壬化石丸浸膏灌胃剂量约75g/kg，相当于3375g生药/kg。
13 观察指标
131 一般情况 每天观察记录大鼠有无血尿，大便情况，活动度，体重变化、进食量及有无死亡。
132 血液生化 实验第15d用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经眼眶静脉采血查ALT、AST、AST/ALT、Urea。
133 组织病理学 大鼠采血后断颈处死并解剖，肉眼观察心、肝、肾、肺外形、体积、颜色有无异常；将肝、肾用10%甲醛固定、石蜡包埋切片、HE染色后光镜下观察肝组织结构、肝细胞，肾小管结构、肾实质改变。
14 统计学方法 数据采用SPSS190统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，两组间均数比较采用两独立样本成组t检验和重复测量数据的方差分析，P<005表示差异有统计学意义。
2 结果
21 一般情况 实验组与对照组均无血尿、大便性状正常、活动度正常。实验组2只、对照组1只大鼠在灌胃后立即死亡，解剖观察各脏器无异常改变，仅见胸腔内约有2mL灌胃液，分析系灌胃溶液误入气管导致窒息死亡。对比进食量，实验组与对照组进食量呈同步变化（见图1）。随时间推移，实验组与对照组体重较前均稳定增长，差异有统计学意义（P<005），两组平均体重差异无统计学意义（P>005），时间与干预因素不存在交互作用（P>005），表明癸壬化石丸对体重无明显影响。
22 血液生化 实验组与对照组比较，差异无统计学意义（P>005）。
23 肉眼观察各脏器 实验组与对照组心、肝、肾、肺外形、体积、颜色无异常。
24 病理组织检查 对照组肝、肾均正常（见图2、图3）；实验组肝组织结构基本正常，仅见肝细胞轻度水肿；肾小管结构正常，皮髓质分界清，肾小管上皮轻度水肿，局灶可见空泡变性，间质少量淋巴细胞浸润（见图4、图5）。
3 讨论
中医认为肾结石本虚标实，顽固难愈，非一般草木之品所能宣达，必借虫类走窜之品搜剔窜透，方能浊开凝去，邪去正复。癸壬化石丸是根据中医药“清热利湿，化瘀通络，补益肝肾等法于一方，攻补兼施，溶排相合”理论，结合现代生物学研究，根据肾结石的特点研制的内服中药。前期研究表明癸壬化石丸无明显毒副作用，为进一步评价其安全性，开展了本次研究。
动物排尿、排便、活动、进食量、体重变化是综合反映药物毒性对机体代谢、健康状况影响的基本指标，本次实验中对照组和实验组大鼠均未见血尿，大便性状、活动度正常，体重稳定增长，进食量呈同步变化，表明癸壬化石丸经口按剂量3375g生药/kg灌胃，连续给药14d对大鼠生长代谢无明显影响（P<005）。肝脏是外源化合物在体内进行生物转化的主要器官，由外源性化合物引起动物肝脏损害时，会引起动物血清中一系列相关酶的变化。肾脏是外源化合物及其代谢产物的主要排泄器官，也是本实验受试药物的主要作用靶器官，通过对肾脏功能生化指标的检测，可了解受试药物对肾脏功能的影响。本研究结果显示对照组和实验组谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、ALT/AST、尿素（Urea）差异无统计学意义（P>005），说明癸壬化石丸连续给药14d对大鼠肝肾功能无影响。内脏是机体发挥生理功能的场所，其组织结构的改变将对机体正常生理功能的发挥产生影响。病理组织检查显示实验组肝脏、肾脏有轻度细胞水肿，肾小管上皮局灶可见空泡变性，间质少量淋巴细胞浸润，均属可逆性改变，提示癸壬化石丸浸膏给药剂量75g/kg，连续给药14d对大鼠肝、肾脏产生了一定影响，发生机制有待进一步研究。
在上述实验条件下，癸壬化石丸浸膏灌胃的安全剂量约为75g/kg，相当于3375g生药/kg，相当于人临床用量的20250倍（人临床用量为100g/60kg），连续经口给药14d对大鼠的体重、血液生化指标等均无明显影响，而在该剂量范围内对大鼠心、肝、肾、肺等脏器组织也无可见病变损伤，因此癸壬化石丸无明显的亚急性毒性，安全性较高。
参考文献
[1]师晶丽.中医肾病临床实践[M].贵阳：贵州科学技术出版社，2012：53-324.
[2]朱军，沈玉华，谢安建，等.草酸钙型尿结石的研究进展[J].化学世界，2007，3：175-178.
[3]周向文，黄冬梅，吕建新.中医药治疗泌尿系结石临床研究进展亚太传统医药[J].2011，4：151-152.
[4]张广平，叶祖光.有毒中药的“毒性”与毒性分级[J].世界中医药， 2014 ，9 （2）：175-177.
（编辑：梁志庆）
【关键词】 癸壬化石丸；大鼠；肾结石；亚急性毒性
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）23-0046-03
肾结石是泌尿系统常见病，发病率在15%左右，尤其是中国川南地区发病率极高[1]，且采用手术治疗术后再发率高达50%左右[2-3]。西药枸橼酸盐、镁制剂、磷酸盐、乙酰半胱氨酸等对结石直径>06cm的患者效果不明显，且副作用较大。癸壬化石丸治疗肾结石在川南地区经较长时间应用，临床效果显著，拟开发为国家新药。前期试验研究结果表明[4]，癸壬化石丸对大鼠的急性毒性经口LD50>500g/kg，按急性毒性分级标准规定，该受试物为无毒级。本研究进行大鼠的亚急性毒性试验，旨在进一步探讨癸壬化石丸的毒性作用，对其安全性进行评价，为临床提供理论依据。
1 材料与方法
11 材料
111 实验动物 SPF级SD大鼠20只，体重（200±20）g，雌雄各半，西南医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）2013-17。
112 药物 生理盐水（批号：15042343，美大康佳乐药业）；5%吐温80 （批号：080928，成都金山化学试剂）；癸壬化石丸浸膏（西南医科大附属中医院制备）；戊巴比妥钠（批号：F20050405，上海化学）。
12 方法 前期采用限量实验，癸壬化石丸对大鼠的急性毒性经口LD50>500g/kg，按急性毒性分级标准规定，该受试物为无毒级。对照组用50%吐温80+生理盐水灌胃3mL/（次·d），连续14d。实验组用癸壬化石丸最大使用浓度灌胃，即癸壬化石丸浸膏+50%吐温80+生理盐水配置成05g/mL混悬液（相当于生药浓度285g/mL）灌胃3mL/（次·d），连续14d。每次癸壬化石丸浸膏灌胃剂量约75g/kg，相当于3375g生药/kg。
13 观察指标
131 一般情况 每天观察记录大鼠有无血尿，大便情况，活动度，体重变化、进食量及有无死亡。
132 血液生化 实验第15d用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经眼眶静脉采血查ALT、AST、AST/ALT、Urea。
133 组织病理学 大鼠采血后断颈处死并解剖，肉眼观察心、肝、肾、肺外形、体积、颜色有无异常；将肝、肾用10%甲醛固定、石蜡包埋切片、HE染色后光镜下观察肝组织结构、肝细胞，肾小管结构、肾实质改变。
14 统计学方法 数据采用SPSS190统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，两组间均数比较采用两独立样本成组t检验和重复测量数据的方差分析，P<005表示差异有统计学意义。
2 结果
21 一般情况 实验组与对照组均无血尿、大便性状正常、活动度正常。实验组2只、对照组1只大鼠在灌胃后立即死亡，解剖观察各脏器无异常改变，仅见胸腔内约有2mL灌胃液，分析系灌胃溶液误入气管导致窒息死亡。对比进食量，实验组与对照组进食量呈同步变化（见图1）。随时间推移，实验组与对照组体重较前均稳定增长，差异有统计学意义（P<005），两组平均体重差异无统计学意义（P>005），时间与干预因素不存在交互作用（P>005），表明癸壬化石丸对体重无明显影响。
22 血液生化 实验组与对照组比较，差异无统计学意义（P>005）。
23 肉眼观察各脏器 实验组与对照组心、肝、肾、肺外形、体积、颜色无异常。
24 病理组织检查 对照组肝、肾均正常（见图2、图3）；实验组肝组织结构基本正常，仅见肝细胞轻度水肿；肾小管结构正常，皮髓质分界清，肾小管上皮轻度水肿，局灶可见空泡变性，间质少量淋巴细胞浸润（见图4、图5）。
3 讨论
中医认为肾结石本虚标实，顽固难愈，非一般草木之品所能宣达，必借虫类走窜之品搜剔窜透，方能浊开凝去，邪去正复。癸壬化石丸是根据中医药“清热利湿，化瘀通络，补益肝肾等法于一方，攻补兼施，溶排相合”理论，结合现代生物学研究，根据肾结石的特点研制的内服中药。前期研究表明癸壬化石丸无明显毒副作用，为进一步评价其安全性，开展了本次研究。
动物排尿、排便、活动、进食量、体重变化是综合反映药物毒性对机体代谢、健康状况影响的基本指标，本次实验中对照组和实验组大鼠均未见血尿，大便性状、活动度正常，体重稳定增长，进食量呈同步变化，表明癸壬化石丸经口按剂量3375g生药/kg灌胃，连续给药14d对大鼠生长代谢无明显影响（P<005）。肝脏是外源化合物在体内进行生物转化的主要器官，由外源性化合物引起动物肝脏损害时，会引起动物血清中一系列相关酶的变化。肾脏是外源化合物及其代谢产物的主要排泄器官，也是本实验受试药物的主要作用靶器官，通过对肾脏功能生化指标的检测，可了解受试药物对肾脏功能的影响。本研究结果显示对照组和实验组谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、ALT/AST、尿素（Urea）差异无统计学意义（P>005），说明癸壬化石丸连续给药14d对大鼠肝肾功能无影响。内脏是机体发挥生理功能的场所，其组织结构的改变将对机体正常生理功能的发挥产生影响。病理组织检查显示实验组肝脏、肾脏有轻度细胞水肿，肾小管上皮局灶可见空泡变性，间质少量淋巴细胞浸润，均属可逆性改变，提示癸壬化石丸浸膏给药剂量75g/kg，连续给药14d对大鼠肝、肾脏产生了一定影响，发生机制有待进一步研究。
在上述实验条件下，癸壬化石丸浸膏灌胃的安全剂量约为75g/kg，相当于3375g生药/kg，相当于人临床用量的20250倍（人临床用量为100g/60kg），连续经口给药14d对大鼠的体重、血液生化指标等均无明显影响，而在该剂量范围内对大鼠心、肝、肾、肺等脏器组织也无可见病变损伤，因此癸壬化石丸无明显的亚急性毒性，安全性较高。
参考文献
[1]师晶丽.中医肾病临床实践[M].贵阳：贵州科学技术出版社，2012：53-324.
[2]朱军，沈玉华，谢安建，等.草酸钙型尿结石的研究进展[J].化学世界，2007，3：175-178.
[3]周向文，黄冬梅，吕建新.中医药治疗泌尿系结石临床研究进展亚太传统医药[J].2011，4：151-152.
[4]张广平，叶祖光.有毒中药的“毒性”与毒性分级[J].世界中医药， 2014 ，9 （2）：175-177.
（编辑：梁志庆）