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作者前期实验经"高通量测序"得到T淋巴细胞白血病细胞株基因表达数据,经生物信息学分析得一新序列,暂命名为J441。为了对这一新序列进行进一步深入研究,本实验构建了T淋巴细胞白血病新基因J441与FLAG标签肽融合基因慢病毒载体。
方法引物上引入FLAG标签,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)从T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞中钓取J441的开放阅读框(ORF)片段,形成J441-FLAG融合基因,并将之克隆到带GFP荧光报告基因的慢病毒表达载体质粒pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成pHAGE-J441-FLAG质粒,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。收集含有病毒的上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主Jurkat细胞。观察荧光及测序鉴定293T细胞中J441的表达,细胞免疫荧光检测293T细胞中FLAG的表达及细胞定位,预测J441的细胞定位。
结果核酸序列测序证实成功构建了含J441-FLAG基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为5×1010 ifu/L。重组慢病毒感染293T细胞可以检测到J441与FLAG标签融合基因的表达,初步预测J441在胞质中表达。
结论成功构建了J441-FLAG融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究J441基因的相关功能提供了稳定转染载体,为揭示J441基因在T淋巴细胞白血病的发生发展过程中的重要作用奠定基础。