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摘 要：从江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织中分离到5株病毒分离物。经过实验室鉴定，该5株病毒分离能与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应，并均能使用针对小鹅瘟病毒VP3基因特异性引物扩增出与目的条带大小一致的DNA片段。将PCR产物纯化、连接、转化、TA克隆等一系列实验后将获得阳性重组质粒送测序。另外，为了探究该病毒的遗传进化方向，本研究同时对鹅细小病毒VP3基因进行了系统进化分析。
关键词：鹅细小病毒；琼脂扩散试验；序列测定；遗传进化
中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）04-0066-03
鹅细小病毒病又称小鹅瘟，其作为一种急性传染病给养鹅业造成了重大的经济损失，严重影响了养鹅业的健康发展。该病主要侵害1月龄以内的雏鹅，发病后主要表现为精神萎靡、食欲废绝、严重下痢和渗出性肠炎等症状[1]。该病的病原为鹅细小病毒（Goose ParvoVirus， GPV），属于细小病毒科，细小病毒属；GPV仅有一个血清型[2]，病毒粒径约20 nm，是目前已知的动物病毒中较小、较简单的病毒之一[3]。我国学者方定一于1956年首次在江苏扬州发现并命名为“小鹅瘟”[1]。匈牙利学者德舍氏（Derzsy’s）于1966年首次使用鹅胚分离到该病毒，1974年，世界家禽协会将其正式命名为Derzsy’s病，随后GPV不断蔓延至中国台湾[4]、匈牙利[5，6]、英国[7]、日本[8]、泰国[9]、德国[10]、美国[11]、瑞典[12]和波兰[13]等多个国家和地区，给全球养鹅业造成了严重危害。本研究从江苏省各市鹅场病死雏鹅的肝、脾、肠病料中分离到5株病毒。通过实验室诊断证明所分离的5株野外病毒均为小鹅瘟病毒，本研究中同时对该5株GPV的VP3基因进行序列测定并进行了系统的遗传进化分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织，病料来源及分离时间见表1。
1.1.2 种胚
9～10日龄SPF胚购自北京梅里亚SPF种禽场；鹅胚购自高邮市非免种鹅场。
1.1.3 抗原与血清
GPV琼扩标准抗原、阳性血清均由本研究中心制备。
1.1.4 试剂及仪器
Taq酶、RNA酶、氨苄青霉素、IPTG、X-gal、dNTP、DNA marker、pEASY-T3 Cloning Kit和胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；EDTA、Tris碱、SDS和蛋白酶K购自Sigma公司；EcoRⅠ限制性内切酶购自Fermentas公司；其他试剂均为国产分析纯级；PCR扩增仪为美国ABI公司产品，型号为GeneAmp PCR System 9700；高速冷冻离心机为美国Sigma公司产品，型号为3K15；小鹅瘟病毒VP3基因的特异性引物：P1：5’-CCAAGCTACAACAACCACAT-3’和P2：5’-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3’，目的条带大小为539 bp。
1.2 方法
1.2.1 病毒分离及传代
取具有典型病变鹅的肝、脾、肠组织，剪碎，按1∶3加入灭菌PBS溶液，研磨，匀浆，经超声波处理后， 5 000 r/min离心15 min，反复冻融数次，取上清液加青、链霉素双抗至2 000 U/mL和2 mg/mL，接种非免疫鹅胚，0.2 mL/枚，置38 ℃孵育。收取72 h后死亡鹅胚的尿囊液，分装成若干青霉素小瓶，每瓶1 mL～2 mL，-70 ℃冷冻保存备用。每代设不接种的正常鹅胚作对照。传代时尿囊液均作1∶100稀释，分别接种6～8枚鹅胚，每胚0.2 mL，取72 h～120 h之间死亡的鹅胚尿囊液。
1.2.2 鸡胚接种试验
用上述无菌收集的尿囊液在鸡胚上盲传3代，接种10日龄的鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2 mL，置37 ℃温箱孵育。24 h观察，剔除死胚，继续孵化。以后每天照胚2次，收取孵化过程中死亡的胚，以及接种120 h后仍未死亡的胚的尿囊液。
1.2.3 琼脂扩散试验（AGP）
按照参考文献所述的方法进行抗原纯化浓缩，取死亡胚尿囊液，经6 000 r/min离心20 min弃沉淀，加等量氯仿混合，6 000 r/min离心30 min取上清，经PEG6000弃沉淀浓缩20倍后制成待检抗原[14]。参照《兽医微生物实验指导》中的方法进行琼脂扩散试验[15]。简述之，在琼扩板周围孔加入不同稀释度的标准抗小鹅瘟病毒阳性血清，中心孔依次加入标准抗原、待检病毒分离物和正常鹅胚尿囊液。
1.2.4 红细胞凝集试验
根据前述方法将病毒液进行纯化后浓缩2倍制备待检病毒液。将待检病毒液用磷酸盐缓冲液在“U”型板中进行2倍连续倍比稀释，每孔25 μL，最后1孔加相同体积的磷酸盐缓冲液作对照。随即向各孔内加入25 μL的1 %各种动物的红细胞，充分混匀，37 ℃放置15 min后检查结果。
1.2.5 病毒基因组提取
按照参考文献[4]所述的方法提取GPV各分离株的基因组，简述之：500 μL尿囊液与裂解缓冲液（含有pH8.0的50 mM的Tris，5 mM EDTA， 2 % SDS和200 μg/mL的蛋白酶K）等体积的混合，完全混匀后使用等体积的酚氯仿（苯酚∶氯仿=1∶1）抽提两次，12 000 r/min离心10 min后吸取上清使用两倍体积的无水乙醇进行沉淀，-20 ℃放置10 min后12 000 r/min离心10 min后弃上清，使用70 %的酒精溶液清洗沉淀后TE缓冲液溶解，-20 ℃保存备用。 1.2.6 鹅细小病毒VP3基因的扩增及序列测定
以提取的基因组DNA为模板、P1、P2为引物扩增VP3基因片段。反应条件如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后进行72 ℃延伸5 min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。目的DNA片段与TA克隆载体相连后，经转化、挑斑、摇菌、质粒提取及鉴定后，将含有重组质粒的阳性克隆斑送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因遗传进化分析
将测序结果进行BLAST搜索后，下载并整理了107株小鹅瘟病毒及19番鸭细小病毒VP3基因的序列数据。使用Lasergene7.1软件包中的Meaglin软件进行比对，然后使用BioEdit软件进行序列整理，最后对比对后的序列进行遗传进化分析。遗传进化树利用MEGA 6.0软件中的最大似然法进行构建，软件预测最佳替换模式为K2 G。
2 结果
2.1 病毒分离
鹅胚接种后，多数胚死亡时间在60 h～120 h之间，未接种的对照鹅胚均健康存活。与对照鹅胚相比，感染胚可见绒毛尿囊膜增厚，胚胎发育阻滞，胚体全身严重出血，胚头充血严重（图1）；多数胚胎的心、肝、肾有出血，少数胚胎的心肌苍白。
2.2 鸡胚接种试验结果
10日龄鸡胚接种病毒后，未发生死亡现象，鸡胚血管鲜红，卵黄呈金黄色，尿囊液清澈，胚体发育良好，剖检后无任何病理变化。
2.3 琼脂扩散试验（AGP）结果
琼脂扩散试验结果表明，用死亡鹅胚尿囊液制备的病毒浓缩抗原能与GPV阳性血清发生沉淀反应，并与小鹅瘟诊断抗原和阳性血清形成的沉淀线吻合，结果见图2。
2.4 红细胞凝集试验结果
所有5株病毒分离物均不凝集鸡、鸭、鹅、豚鼠及兔子的红细胞。
2.5 PCR鉴定结果
GPV各分离株VP3基因扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分析，均可见约539 bp的目的条带，DNA大小与预期的结果相符（图3），结果表明这5株病毒分离物中均有GPV。经鸡胚接种实验、琼脂糖扩散实验及PCR检测实验充分证实了这5株病毒分离物均为GPV，并将1～5号病毒分离物分别命名为Goose parvovirus/nanjing/09、Goose parvovirus/taizhou/12、Goose parvovirus/nantong/12、Goose parvovirus/yangzhou/08、Goose parvovirus/yangzhou/11。
2.6 小鹅瘟VP3基因遗传进化分析结果
使用MEGA5.0遗传进化分析软件构建的ML进化树见图4，从遗传进化树来看，GPV与MDPV分布在不同的两个分支，这符合该病毒属一般规律[16， 17]。而GPV又进一步演化为3个分支。本研究中5株GPV分离株中有4株处于国内主要分支上，仅有1株（Goose parvovirus/yangzhou/11）与当前市售活疫苗在同一分支。该结果表明随着GPV病毒在野外的不断遗传变异，该病毒在不断的进化演变，从而出现了较新的基因型。
3 讨论
本研究通过分离及鉴定获得了5株GPV野外分离株，并对这5株GPV进行了系统遗传进化分析。实验结果表明国内主要分支已逐渐形成了新的基因亚型，并且与台湾的主要分离株具有较近的亲缘关系。但台湾因其与大陆相分离的特点，也逐渐出现了与内陆不同基因型的分支，其与波兰、美国、匈牙利、德国、英国及法国形成了国外分支。市售活疫苗为1961年从中国大陆分离到的野毒经多次传代致弱而来，但从当前病毒分离及遗传进化分析结果来看，该分支已逐渐淡去其主要流行的特点，本研究中于2011年分离到的一株病毒是该分支最晚分离到，其他市售疫苗分支上的分离株的分离年代均较久远。根据基因型越相近其免疫保护效果越确实的一般规律[18]，我们分析认为如果使用国内主要分支上的流行株作为疫苗侯选株进行疫苗的开发，更具有生物学意义。
参考文献：（18篇，略）
关键词：鹅细小病毒；琼脂扩散试验；序列测定；遗传进化
中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）04-0066-03
鹅细小病毒病又称小鹅瘟，其作为一种急性传染病给养鹅业造成了重大的经济损失，严重影响了养鹅业的健康发展。该病主要侵害1月龄以内的雏鹅，发病后主要表现为精神萎靡、食欲废绝、严重下痢和渗出性肠炎等症状[1]。该病的病原为鹅细小病毒（Goose ParvoVirus， GPV），属于细小病毒科，细小病毒属；GPV仅有一个血清型[2]，病毒粒径约20 nm，是目前已知的动物病毒中较小、较简单的病毒之一[3]。我国学者方定一于1956年首次在江苏扬州发现并命名为“小鹅瘟”[1]。匈牙利学者德舍氏（Derzsy’s）于1966年首次使用鹅胚分离到该病毒，1974年，世界家禽协会将其正式命名为Derzsy’s病，随后GPV不断蔓延至中国台湾[4]、匈牙利[5，6]、英国[7]、日本[8]、泰国[9]、德国[10]、美国[11]、瑞典[12]和波兰[13]等多个国家和地区，给全球养鹅业造成了严重危害。本研究从江苏省各市鹅场病死雏鹅的肝、脾、肠病料中分离到5株病毒。通过实验室诊断证明所分离的5株野外病毒均为小鹅瘟病毒，本研究中同时对该5株GPV的VP3基因进行序列测定并进行了系统的遗传进化分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织，病料来源及分离时间见表1。
1.1.2 种胚
9～10日龄SPF胚购自北京梅里亚SPF种禽场；鹅胚购自高邮市非免种鹅场。
1.1.3 抗原与血清
GPV琼扩标准抗原、阳性血清均由本研究中心制备。
1.1.4 试剂及仪器
Taq酶、RNA酶、氨苄青霉素、IPTG、X-gal、dNTP、DNA marker、pEASY-T3 Cloning Kit和胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；EDTA、Tris碱、SDS和蛋白酶K购自Sigma公司；EcoRⅠ限制性内切酶购自Fermentas公司；其他试剂均为国产分析纯级；PCR扩增仪为美国ABI公司产品，型号为GeneAmp PCR System 9700；高速冷冻离心机为美国Sigma公司产品，型号为3K15；小鹅瘟病毒VP3基因的特异性引物：P1：5’-CCAAGCTACAACAACCACAT-3’和P2：5’-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3’，目的条带大小为539 bp。
1.2 方法
1.2.1 病毒分离及传代
取具有典型病变鹅的肝、脾、肠组织，剪碎，按1∶3加入灭菌PBS溶液，研磨，匀浆，经超声波处理后， 5 000 r/min离心15 min，反复冻融数次，取上清液加青、链霉素双抗至2 000 U/mL和2 mg/mL，接种非免疫鹅胚，0.2 mL/枚，置38 ℃孵育。收取72 h后死亡鹅胚的尿囊液，分装成若干青霉素小瓶，每瓶1 mL～2 mL，-70 ℃冷冻保存备用。每代设不接种的正常鹅胚作对照。传代时尿囊液均作1∶100稀释，分别接种6～8枚鹅胚，每胚0.2 mL，取72 h～120 h之间死亡的鹅胚尿囊液。
1.2.2 鸡胚接种试验
用上述无菌收集的尿囊液在鸡胚上盲传3代，接种10日龄的鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2 mL，置37 ℃温箱孵育。24 h观察，剔除死胚，继续孵化。以后每天照胚2次，收取孵化过程中死亡的胚，以及接种120 h后仍未死亡的胚的尿囊液。
1.2.3 琼脂扩散试验（AGP）
按照参考文献所述的方法进行抗原纯化浓缩，取死亡胚尿囊液，经6 000 r/min离心20 min弃沉淀，加等量氯仿混合，6 000 r/min离心30 min取上清，经PEG6000弃沉淀浓缩20倍后制成待检抗原[14]。参照《兽医微生物实验指导》中的方法进行琼脂扩散试验[15]。简述之，在琼扩板周围孔加入不同稀释度的标准抗小鹅瘟病毒阳性血清，中心孔依次加入标准抗原、待检病毒分离物和正常鹅胚尿囊液。
1.2.4 红细胞凝集试验
根据前述方法将病毒液进行纯化后浓缩2倍制备待检病毒液。将待检病毒液用磷酸盐缓冲液在“U”型板中进行2倍连续倍比稀释，每孔25 μL，最后1孔加相同体积的磷酸盐缓冲液作对照。随即向各孔内加入25 μL的1 %各种动物的红细胞，充分混匀，37 ℃放置15 min后检查结果。
1.2.5 病毒基因组提取
按照参考文献[4]所述的方法提取GPV各分离株的基因组，简述之：500 μL尿囊液与裂解缓冲液（含有pH8.0的50 mM的Tris，5 mM EDTA， 2 % SDS和200 μg/mL的蛋白酶K）等体积的混合，完全混匀后使用等体积的酚氯仿（苯酚∶氯仿=1∶1）抽提两次，12 000 r/min离心10 min后吸取上清使用两倍体积的无水乙醇进行沉淀，-20 ℃放置10 min后12 000 r/min离心10 min后弃上清，使用70 %的酒精溶液清洗沉淀后TE缓冲液溶解，-20 ℃保存备用。 1.2.6 鹅细小病毒VP3基因的扩增及序列测定
以提取的基因组DNA为模板、P1、P2为引物扩增VP3基因片段。反应条件如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后进行72 ℃延伸5 min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。目的DNA片段与TA克隆载体相连后，经转化、挑斑、摇菌、质粒提取及鉴定后，将含有重组质粒的阳性克隆斑送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因遗传进化分析
将测序结果进行BLAST搜索后，下载并整理了107株小鹅瘟病毒及19番鸭细小病毒VP3基因的序列数据。使用Lasergene7.1软件包中的Meaglin软件进行比对，然后使用BioEdit软件进行序列整理，最后对比对后的序列进行遗传进化分析。遗传进化树利用MEGA 6.0软件中的最大似然法进行构建，软件预测最佳替换模式为K2 G。
2 结果
2.1 病毒分离
鹅胚接种后，多数胚死亡时间在60 h～120 h之间，未接种的对照鹅胚均健康存活。与对照鹅胚相比，感染胚可见绒毛尿囊膜增厚，胚胎发育阻滞，胚体全身严重出血，胚头充血严重（图1）；多数胚胎的心、肝、肾有出血，少数胚胎的心肌苍白。
2.2 鸡胚接种试验结果
10日龄鸡胚接种病毒后，未发生死亡现象，鸡胚血管鲜红，卵黄呈金黄色，尿囊液清澈，胚体发育良好，剖检后无任何病理变化。
2.3 琼脂扩散试验（AGP）结果
琼脂扩散试验结果表明，用死亡鹅胚尿囊液制备的病毒浓缩抗原能与GPV阳性血清发生沉淀反应，并与小鹅瘟诊断抗原和阳性血清形成的沉淀线吻合，结果见图2。
2.4 红细胞凝集试验结果
所有5株病毒分离物均不凝集鸡、鸭、鹅、豚鼠及兔子的红细胞。
2.5 PCR鉴定结果
GPV各分离株VP3基因扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分析，均可见约539 bp的目的条带，DNA大小与预期的结果相符（图3），结果表明这5株病毒分离物中均有GPV。经鸡胚接种实验、琼脂糖扩散实验及PCR检测实验充分证实了这5株病毒分离物均为GPV，并将1～5号病毒分离物分别命名为Goose parvovirus/nanjing/09、Goose parvovirus/taizhou/12、Goose parvovirus/nantong/12、Goose parvovirus/yangzhou/08、Goose parvovirus/yangzhou/11。
2.6 小鹅瘟VP3基因遗传进化分析结果
使用MEGA5.0遗传进化分析软件构建的ML进化树见图4，从遗传进化树来看，GPV与MDPV分布在不同的两个分支，这符合该病毒属一般规律[16， 17]。而GPV又进一步演化为3个分支。本研究中5株GPV分离株中有4株处于国内主要分支上，仅有1株（Goose parvovirus/yangzhou/11）与当前市售活疫苗在同一分支。该结果表明随着GPV病毒在野外的不断遗传变异，该病毒在不断的进化演变，从而出现了较新的基因型。
3 讨论
本研究通过分离及鉴定获得了5株GPV野外分离株，并对这5株GPV进行了系统遗传进化分析。实验结果表明国内主要分支已逐渐形成了新的基因亚型，并且与台湾的主要分离株具有较近的亲缘关系。但台湾因其与大陆相分离的特点，也逐渐出现了与内陆不同基因型的分支，其与波兰、美国、匈牙利、德国、英国及法国形成了国外分支。市售活疫苗为1961年从中国大陆分离到的野毒经多次传代致弱而来，但从当前病毒分离及遗传进化分析结果来看，该分支已逐渐淡去其主要流行的特点，本研究中于2011年分离到的一株病毒是该分支最晚分离到，其他市售疫苗分支上的分离株的分离年代均较久远。根据基因型越相近其免疫保护效果越确实的一般规律[18]，我们分析认为如果使用国内主要分支上的流行株作为疫苗侯选株进行疫苗的开发，更具有生物学意义。
参考文献：（18篇，略）