论文部分内容阅读
摘要 利用組织培养技术研究过山蕨种苗快繁技术体系，包括孢子囊的消毒方法、孢子萌发培养基、配子体增殖培养基以及幼孢子体诱导基质，结果表明：较好的孢子囊消毒方法是70%酒精 5%次氯酸钠组合，适合过山蕨孢子萌发和配子体生长发育的培养基是MS 2%蔗糖 0.7%琼脂，pH值6.0；适合配子体增殖的培养基为MS 2%蔗糖 0.7%琼脂 0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，pH值6.0；适合幼孢子体诱导的基质配比是草炭 细河沙（1∶1）。
关键词 过山蕨；组培；快繁
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）22-0061-02
Absrtact Using tissue culture technology to research rapid propagation technology of Camptosorus sibiricus Rupr，including the spore sac disinfection methods，spore germination medium and young sporophyte inducing matrix.The results showed that better spore sac disinfection method is 70% alcohol 0.5% NaClO combination，Suitable medium for spores germination and gametophyte growth is MS 2% sucrose 0.7% agar，pH 6.0；Suitable medium for gametophyte proliferation is MS 2% sucrose 0.7% agar 0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，pH 6.0；Suitable matrix ratio for young sporophyte induced is peat small particles river sand （1∶1）.
Key words Camptosorus sibiricus Rupr；tissue culture；rapid propagation
過山蕨（Camptosorus sibiricus Rupr）又名过桥草、马蹬草等，为铁角蕨科植物，以地上部分入药，河南省伏牛山、大别山、桐柏山等山区均有分布。过山蕨性平味淡，具有活血化瘀、消炎止痛、止血、解毒等功效，民间多以其治疗动脉炎症、外伤出血、子宫出血、偏瘫、下肢溃疡、肝炎等症。过山蕨主含三萜类、黄酮类、苯丙素类、酚酸类、有机酸类、含硫化合物、糖类、脂肪酸及其苷类等化学成分，药理研究发现其具有抗肿瘤、抗氧化、扩张血管、抑制血小板聚集、抗艾滋病等作用[1-2]。市场所售过山蕨多为野生，因其生长缓慢，野外繁殖率低，过度采挖造成过山蕨野生资源急剧下降，2005年被收载入《河南省重点保护植物名录》。目前，过山蕨繁殖普遍采用分株法，繁殖速度较慢，远不能满足日益增长的市场需求。因此，利用组培技术进行过山蕨种苗的快速繁殖技术研究，是保护和利用过山蕨的必要途径。本试验筛选出过山蕨孢子萌发培养基、配子体增殖培养基及幼孢子体诱导最佳基质配比，从而建立过山蕨种苗的快速繁殖技术体系，以便稳定、高效生产过山蕨种苗，缓解野生资源压力，满足市场需求。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采集河南省南阳市西峡县太平镇山区野生过山蕨植株，由河南农业大学中药材工程技术研究中心高致明教授鉴定为铁角蕨科过山蕨（Camptosorus sibiricus Rupr），种植于南阳理工学院张仲景药用植物园，待孢子成熟以后，采集孢子囊放入冰箱冷藏备用。
1.2 试验方法
1.2.1 孢子囊的消毒。将过山蕨孢子囊用滤纸包好，消毒方法：①70%酒精。消毒15～25 s，无菌水漂洗4～5次；②5%次氯酸钠。消毒5 min，无菌水漂洗4～5次；③0.1%升汞。消毒5～8 min，无菌水漂洗4～5次；④70%酒精 5%次氯酸钠。先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次；⑤70%酒精 0.1%升汞。先用70%酒精消毒15～25 s，再用0.1%升汞消毒5～8 min，无菌水漂洗4～5次；⑥5%次氯酸钠 0.1%升汞。先用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次，再用0.1%升汞消毒5～8 min，无菌水漂洗4～5次。消毒后的孢子囊无菌条件下接种至MS培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶接种3～5个孢子囊，3次重复。30 d后，观察孢子萌发率和污染率，筛选最佳消毒方法。
1.2.2 孢子萌发。将过山蕨孢子囊用滤纸包好，先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次，将消毒后的孢子囊无菌条件下接种至不同无机盐含量（MS、1/2MS、1/4MS和1/8MS，蔗糖浓度2%，琼脂0.7%，pH值6.0）和不同蔗糖浓度（MS，琼脂0.7%，蔗糖浓度1%、2%、3%、4%，pH值6.0）的培养基上，每种培养基接种10瓶，每瓶接种3～5个孢子囊，3次重复。观察孢子萌发时间、萌发率，60 d后观察配子体生长情况。
1.2.3 配子体增殖。孢子萌发后形成的配子体，接种到不同生长调节剂配比的MS培养基上，考察不同生长调节剂配比的培养基对过山蕨配子体增殖的影响。植物生长调节剂选择不同浓度6-BA（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L）和不同浓度NAA（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L），每种配比分别编号，每个编号接种5瓶，3次重复，接种前称重，培养30 d后再取出称重，计算增值倍数（培养后的重量/接种前的重量）。 1.2.4 幼孢子体诱导。配子体无菌条件下接种至草炭、蛭石、细河沙、草炭 蛭石（1∶1）、草炭 细河沙（1∶1）、草炭 园土（1∶1）、蛭石 细河沙（1∶1）等不同培养基上，考察不同基质配比对幼孢子体诱导的影响。各基质水分含量均应满足液面与基质面相平，倾斜有水溢出[3-4]。
1.3 培养条件
各处理的培养条件均为空气湿度80%，光照强度2 000 lx，每天光照时间12 h，温度25 ℃[5]。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方式对孢子萌发及污染率的影响
采用6种不同的消毒方法对过山蕨孢子囊消毒，从表1可以看出，各消毒方式对过山蕨的孢子萌发率和污染率有显著或极显著差异，消毒效果不同。其中，单一使用70%酒精和0.5%次氯酸钠或者两者配合使用，孢子萌发率较其他几种方法较低，且污染率与其他几种方式相比较高，但均不超过8%的经验污染率值，属正常范围内。单独使用0.1%升汞或与70%酒精和0.5%次氯酸钠配合使用，污染率均较低，萌发率较高，但考虑升汞易挥发，且对人体危害较大，综合考虑，过山蕨孢子囊的消毒方式以萌发率较高、污染率较低、消毒效果较好的70%酒精 5%次氯酸钠组合为好。
2.2 不同培养基对孢子萌发的影响
2.2.1 无机盐浓度对孢子萌发的影响。从表2可以看出，不同无机盐浓度对孢子的萌发和配子体的生长影响较大，其中，较高的无机盐浓度有利于孢子萌发和配子体的生长，低浓度的无机盐不利于孢子萌发和配子体的生长，且无机盐浓度过低如1/8MS，配子体生长势较弱，甚至有部分萌发的配子体因营养不足而死亡。
2.2.2 蔗糖浓度对孢子萌发的影响。从表3可以看出，当蔗糖浓度为4%时，孢子萌发时间晚，且萌发率低，配子体颜色枯黄，生长势弱，这可能与高浓度蔗糖形成高渗液面从而抑制过山蕨孢子萌发和配子体的发育有关。当蔗糖浓度为2%时，其萌发天数、萌发率、配子体颜色、配子体生长势均占优势。
综合表2、表3数据可知，有利于过山蕨孢子萌发和配子体生长发育的培养基是MS 2%蔗糖 琼脂0.7%，pH值6.0。
2.3 不同生长调节剂配比对配子体增殖的影响
从表4可以看出，各个生长调节剂配比条件下配子体颜色均为翠绿，且均无幼孢子体的分化，表现一致，但其增殖倍数和生长势差异较大。其总体表现为6-BA浓度大于NAA浓度时，配子体生长势较强，增殖倍数较大，反之，则较小，而且高浓度的NAA有明显地抑制配子体发育的趋向。结合增殖倍数与生长势，有利于配子体增殖的生长调节剂配比为0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，培养基为MS 2%蔗糖 琼脂0.7% 0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，pH值6.0。
2.4 不同基质配比对幼孢子体诱导的影响
由配子体增殖试验可知，不管如何改变培养基，均不能诱导出过山蕨的孢子体，所以采用不同配比的栽培基质进行诱导，结果见表5。可以看出，不同基质配比对过山蕨幼孢子体的诱导效果是不同的，从诱导率来看，蛭石 细河沙（1∶1）组合的诱导率最高，为93%，但幼孢子体的生长势一般；细河沙、草炭 细河沙（1∶1）的诱导率次之，但细河沙的生长势一般，草炭 细河沙（1∶1）的生长势较强；草炭的诱导率最低，为41%，可能与其团粒结构不利于配子体上精子的游动有关。综上所述，利于配子体诱导成为幼孢子体的基质配比是草炭 细河沙（1∶1）。
3 结论与讨论
利用组培技术进行过山蕨种苗快繁，外植体的消毒至关重要，本试验筛选出较好的孢子囊消毒方法，即先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次，但其他外植体如嫩叶、茎尖、根状茎等的消毒方法没有考察。
过山蕨的生长发育需经历2个阶段，即配子体阶段和孢子体阶段。无机盐浓度和蔗糖浓度对过山蕨孢子的萌发及配子体的生长发育以及不同生长调节剂配比对过山蕨配子体的增殖影响较大，本试验筛选出利于过山蕨孢子萌发和配子体生长发育的培养基是MS 2%蔗糖 琼脂0.7%，利于配子体增殖的培养基为MS 2%蔗糖 琼脂0.7% 0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，增殖培养基是否适合孢子萌发，即生长调节剂对孢子萌发是否产生影响，有待进一步研究[6-8]。
過山蕨配子体的精子必须借助水才能与卵子结合，之后形成孢子体，培养基内水分含量不能满足精子的游动，所以组培瓶内没有幼孢子体的出现。不同基质的物理性质、蓄水能力都会影响幼孢子体的诱导和生长发育，本试验筛选出一种利于配子体诱导成为幼孢子体的基质配比，即草炭 细河沙（1∶1），且基质水分含量均应满足液面与基质面相平，倾斜有水溢出的要求[9-11]。
4 参考文献
[1] 陆树刚.蕨类植物学[M].北京：高等教育出版社，2007：53.
[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会，吴兆洪.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999.
[3] 包文美，王全喜，敖志文.东北蕨类植物配子体发育的研究：铁角蕨科[J].植物研究，1995，15（1）：61-66.
[4] 杨鑫宝，刘建勋，杨秀伟，等.过山蕨化学成分及药理活性研究进展[J].中国现代中药，2012，14（5）：19-20.
[5] 李宁，吴永军，李铣，等.过山蕨的化学成分研究[J].中草药，2008，39（1）：34.
[6] 董诚明，罗晓铮，王春雷，等.伏牛山药用植物资源研究[J].时珍国医国药，2008，19（4）：801-802.
[7] 翁梅，孙静，叶永忠.河南省重点保护植物优先保护等级划分研究[J].河南农业科学，2012，41（1）：129-133.
[8] 鲁翠涛，梅兴国，钟凡，等.蕨类植物孢子萌发影响因素的研究进展[J].广西植物，2002，22（6）：506.
[9] 张宝凤，王世久，潘文军，等.过山蕨治疗心血管疾病的研究[J].沈阳药学院学报，1977，27（11）：33-35.
[10] 罗顺元，王任翔.假鞭叶铁线蕨孢子的组织培养[J].植物生理学通讯，2007，43（1）：131-132.
[11] 馬丹丹，陈征海，张芬耀，等.浙江铁角蕨科：地理分布新记录属种[J].浙江农林大学学报，2015，32（3）：488-489.
关键词 过山蕨；组培；快繁
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）22-0061-02
Absrtact Using tissue culture technology to research rapid propagation technology of Camptosorus sibiricus Rupr，including the spore sac disinfection methods，spore germination medium and young sporophyte inducing matrix.The results showed that better spore sac disinfection method is 70% alcohol 0.5% NaClO combination，Suitable medium for spores germination and gametophyte growth is MS 2% sucrose 0.7% agar，pH 6.0；Suitable medium for gametophyte proliferation is MS 2% sucrose 0.7% agar 0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，pH 6.0；Suitable matrix ratio for young sporophyte induced is peat small particles river sand （1∶1）.
Key words Camptosorus sibiricus Rupr；tissue culture；rapid propagation
過山蕨（Camptosorus sibiricus Rupr）又名过桥草、马蹬草等，为铁角蕨科植物，以地上部分入药，河南省伏牛山、大别山、桐柏山等山区均有分布。过山蕨性平味淡，具有活血化瘀、消炎止痛、止血、解毒等功效，民间多以其治疗动脉炎症、外伤出血、子宫出血、偏瘫、下肢溃疡、肝炎等症。过山蕨主含三萜类、黄酮类、苯丙素类、酚酸类、有机酸类、含硫化合物、糖类、脂肪酸及其苷类等化学成分，药理研究发现其具有抗肿瘤、抗氧化、扩张血管、抑制血小板聚集、抗艾滋病等作用[1-2]。市场所售过山蕨多为野生，因其生长缓慢，野外繁殖率低，过度采挖造成过山蕨野生资源急剧下降，2005年被收载入《河南省重点保护植物名录》。目前，过山蕨繁殖普遍采用分株法，繁殖速度较慢，远不能满足日益增长的市场需求。因此，利用组培技术进行过山蕨种苗的快速繁殖技术研究，是保护和利用过山蕨的必要途径。本试验筛选出过山蕨孢子萌发培养基、配子体增殖培养基及幼孢子体诱导最佳基质配比，从而建立过山蕨种苗的快速繁殖技术体系，以便稳定、高效生产过山蕨种苗，缓解野生资源压力，满足市场需求。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采集河南省南阳市西峡县太平镇山区野生过山蕨植株，由河南农业大学中药材工程技术研究中心高致明教授鉴定为铁角蕨科过山蕨（Camptosorus sibiricus Rupr），种植于南阳理工学院张仲景药用植物园，待孢子成熟以后，采集孢子囊放入冰箱冷藏备用。
1.2 试验方法
1.2.1 孢子囊的消毒。将过山蕨孢子囊用滤纸包好，消毒方法：①70%酒精。消毒15～25 s，无菌水漂洗4～5次；②5%次氯酸钠。消毒5 min，无菌水漂洗4～5次；③0.1%升汞。消毒5～8 min，无菌水漂洗4～5次；④70%酒精 5%次氯酸钠。先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次；⑤70%酒精 0.1%升汞。先用70%酒精消毒15～25 s，再用0.1%升汞消毒5～8 min，无菌水漂洗4～5次；⑥5%次氯酸钠 0.1%升汞。先用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次，再用0.1%升汞消毒5～8 min，无菌水漂洗4～5次。消毒后的孢子囊无菌条件下接种至MS培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶接种3～5个孢子囊，3次重复。30 d后，观察孢子萌发率和污染率，筛选最佳消毒方法。
1.2.2 孢子萌发。将过山蕨孢子囊用滤纸包好，先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次，将消毒后的孢子囊无菌条件下接种至不同无机盐含量（MS、1/2MS、1/4MS和1/8MS，蔗糖浓度2%，琼脂0.7%，pH值6.0）和不同蔗糖浓度（MS，琼脂0.7%，蔗糖浓度1%、2%、3%、4%，pH值6.0）的培养基上，每种培养基接种10瓶，每瓶接种3～5个孢子囊，3次重复。观察孢子萌发时间、萌发率，60 d后观察配子体生长情况。
1.2.3 配子体增殖。孢子萌发后形成的配子体，接种到不同生长调节剂配比的MS培养基上，考察不同生长调节剂配比的培养基对过山蕨配子体增殖的影响。植物生长调节剂选择不同浓度6-BA（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L）和不同浓度NAA（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L），每种配比分别编号，每个编号接种5瓶，3次重复，接种前称重，培养30 d后再取出称重，计算增值倍数（培养后的重量/接种前的重量）。 1.2.4 幼孢子体诱导。配子体无菌条件下接种至草炭、蛭石、细河沙、草炭 蛭石（1∶1）、草炭 细河沙（1∶1）、草炭 园土（1∶1）、蛭石 细河沙（1∶1）等不同培养基上，考察不同基质配比对幼孢子体诱导的影响。各基质水分含量均应满足液面与基质面相平，倾斜有水溢出[3-4]。
1.3 培养条件
各处理的培养条件均为空气湿度80%，光照强度2 000 lx，每天光照时间12 h，温度25 ℃[5]。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方式对孢子萌发及污染率的影响
采用6种不同的消毒方法对过山蕨孢子囊消毒，从表1可以看出，各消毒方式对过山蕨的孢子萌发率和污染率有显著或极显著差异，消毒效果不同。其中，单一使用70%酒精和0.5%次氯酸钠或者两者配合使用，孢子萌发率较其他几种方法较低，且污染率与其他几种方式相比较高，但均不超过8%的经验污染率值，属正常范围内。单独使用0.1%升汞或与70%酒精和0.5%次氯酸钠配合使用，污染率均较低，萌发率较高，但考虑升汞易挥发，且对人体危害较大，综合考虑，过山蕨孢子囊的消毒方式以萌发率较高、污染率较低、消毒效果较好的70%酒精 5%次氯酸钠组合为好。
2.2 不同培养基对孢子萌发的影响
2.2.1 无机盐浓度对孢子萌发的影响。从表2可以看出，不同无机盐浓度对孢子的萌发和配子体的生长影响较大，其中，较高的无机盐浓度有利于孢子萌发和配子体的生长，低浓度的无机盐不利于孢子萌发和配子体的生长，且无机盐浓度过低如1/8MS，配子体生长势较弱，甚至有部分萌发的配子体因营养不足而死亡。
2.2.2 蔗糖浓度对孢子萌发的影响。从表3可以看出，当蔗糖浓度为4%时，孢子萌发时间晚，且萌发率低，配子体颜色枯黄，生长势弱，这可能与高浓度蔗糖形成高渗液面从而抑制过山蕨孢子萌发和配子体的发育有关。当蔗糖浓度为2%时，其萌发天数、萌发率、配子体颜色、配子体生长势均占优势。
综合表2、表3数据可知，有利于过山蕨孢子萌发和配子体生长发育的培养基是MS 2%蔗糖 琼脂0.7%，pH值6.0。
2.3 不同生长调节剂配比对配子体增殖的影响
从表4可以看出，各个生长调节剂配比条件下配子体颜色均为翠绿，且均无幼孢子体的分化，表现一致，但其增殖倍数和生长势差异较大。其总体表现为6-BA浓度大于NAA浓度时，配子体生长势较强，增殖倍数较大，反之，则较小，而且高浓度的NAA有明显地抑制配子体发育的趋向。结合增殖倍数与生长势，有利于配子体增殖的生长调节剂配比为0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，培养基为MS 2%蔗糖 琼脂0.7% 0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，pH值6.0。
2.4 不同基质配比对幼孢子体诱导的影响
由配子体增殖试验可知，不管如何改变培养基，均不能诱导出过山蕨的孢子体，所以采用不同配比的栽培基质进行诱导，结果见表5。可以看出，不同基质配比对过山蕨幼孢子体的诱导效果是不同的，从诱导率来看，蛭石 细河沙（1∶1）组合的诱导率最高，为93%，但幼孢子体的生长势一般；细河沙、草炭 细河沙（1∶1）的诱导率次之，但细河沙的生长势一般，草炭 细河沙（1∶1）的生长势较强；草炭的诱导率最低，为41%，可能与其团粒结构不利于配子体上精子的游动有关。综上所述，利于配子体诱导成为幼孢子体的基质配比是草炭 细河沙（1∶1）。
3 结论与讨论
利用组培技术进行过山蕨种苗快繁，外植体的消毒至关重要，本试验筛选出较好的孢子囊消毒方法，即先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水漂洗4～5次，但其他外植体如嫩叶、茎尖、根状茎等的消毒方法没有考察。
过山蕨的生长发育需经历2个阶段，即配子体阶段和孢子体阶段。无机盐浓度和蔗糖浓度对过山蕨孢子的萌发及配子体的生长发育以及不同生长调节剂配比对过山蕨配子体的增殖影响较大，本试验筛选出利于过山蕨孢子萌发和配子体生长发育的培养基是MS 2%蔗糖 琼脂0.7%，利于配子体增殖的培养基为MS 2%蔗糖 琼脂0.7% 0.2 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA，增殖培养基是否适合孢子萌发，即生长调节剂对孢子萌发是否产生影响，有待进一步研究[6-8]。
過山蕨配子体的精子必须借助水才能与卵子结合，之后形成孢子体，培养基内水分含量不能满足精子的游动，所以组培瓶内没有幼孢子体的出现。不同基质的物理性质、蓄水能力都会影响幼孢子体的诱导和生长发育，本试验筛选出一种利于配子体诱导成为幼孢子体的基质配比，即草炭 细河沙（1∶1），且基质水分含量均应满足液面与基质面相平，倾斜有水溢出的要求[9-11]。
4 参考文献
[1] 陆树刚.蕨类植物学[M].北京：高等教育出版社，2007：53.
[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会，吴兆洪.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999.
[3] 包文美，王全喜，敖志文.东北蕨类植物配子体发育的研究：铁角蕨科[J].植物研究，1995，15（1）：61-66.
[4] 杨鑫宝，刘建勋，杨秀伟，等.过山蕨化学成分及药理活性研究进展[J].中国现代中药，2012，14（5）：19-20.
[5] 李宁，吴永军，李铣，等.过山蕨的化学成分研究[J].中草药，2008，39（1）：34.
[6] 董诚明，罗晓铮，王春雷，等.伏牛山药用植物资源研究[J].时珍国医国药，2008，19（4）：801-802.
[7] 翁梅，孙静，叶永忠.河南省重点保护植物优先保护等级划分研究[J].河南农业科学，2012，41（1）：129-133.
[8] 鲁翠涛，梅兴国，钟凡，等.蕨类植物孢子萌发影响因素的研究进展[J].广西植物，2002，22（6）：506.
[9] 张宝凤，王世久，潘文军，等.过山蕨治疗心血管疾病的研究[J].沈阳药学院学报，1977，27（11）：33-35.
[10] 罗顺元，王任翔.假鞭叶铁线蕨孢子的组织培养[J].植物生理学通讯，2007，43（1）：131-132.
[11] 馬丹丹，陈征海，张芬耀，等.浙江铁角蕨科：地理分布新记录属种[J].浙江农林大学学报，2015，32（3）：488-489.