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摘要[目的]研究细叶石仙桃提取物石油醚部位对自由基的清除活性。[方法]采用石油醚溶剂得到细叶石仙桃石油醚提取物，并研究其对DPPH自由基和羟自由基的清除能力。以芦丁为对照品，测定其总黄酮含量。[结果]细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH清除率在高药液浓度时达到最大值，对羟自由基清除率最高可达到100%。[结论]细叶石仙桃石油醚提取物具有优异的自由基清除活性。
关键词细叶石仙桃;DPPH;羟自由基;清除能力;总黄酮含量
中图分类号TS202.3文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）01-0174-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.052
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
活性氧（ROS）由自由基（如超氧阴离子和羟基自由基）和非自由基物种（如H2O2和单氧）组成，是不同形式的活性氧。ROS是由所有需氧生物产生的，并且可以容易地与包括蛋白质、脂类、lipoproteins和DNA在内的大多数生物分子发生反应。因此，充足的ROS导致各种病理生理紊乱，如关节炎、糖尿病、炎症、癌症和遗传毒性。因此，需要使用抗氧化剂来抵抗氧化应激和ROS的毒性作用[1-3]。由于合成的抗氧化剂副作用多，近年来科研工作者致力于寻找来源于植物的天然抗氧化剂[4-9]。细叶石仙桃作为一种常用的草药，其抗氧化方面的研究未见报道。通过冷浸法得到细叶石仙桃石油醚提取物，测定其总黄酮含量，并采用DPPH和羟自由基体系，评估其对自由基的清除能力。
1材料与方法
1.1仪器与材料
UV1901型紫外可见分光光度计（北京普析电子科技有限公司）。细叶石仙桃药材购于广西百色。芦丁标准品购于百灵威试剂公司（北京）。所有试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1细叶石仙桃石油醚提取物制备。
称取20g细叶石仙
桃粉末，加入200mL石油醚（95%），冷浸72h。重复上述操作3次，合并提取液。旋转蒸发回收溶剂，得到细叶石仙桃石油醚提取物。
1.2.2总黄酮含量测定。
1.2.2.1标准曲线测定。
精密吸取芦丁对照品溶液（lmg/mL）于10mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.4mL，静置6min，加入5%硝酸铝0.4mL，静置6min。加5%氢氧化钠试液4.0mL，用95%石油醚稀释至刻度，摇匀。静置15min，在510nm处测定吸收度。以吸收度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，推出回归方程。
1.2.2.2细叶石仙桃石油醚提取物总黄酮含量测定。
将芦丁标准溶液换为固定浓度提取物溶液，同上操作测定吸光度，多次测量求平均值。根据标准曲线计算总黄酮的芦丁当量，总黄酮含量以每克干物质的芦丁当量（mg）表示，并计算提取得率。
1.2.3二苯基苦味肼基自由基（DPPH）体系[4]。
取不同浓度细叶石仙桃石油醚提取物溶液（0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0mg/mL）加入8mLDPPH（0.004%）溶液中。在最大波长处（517nm）测吸光度，直到平衡为止。清除率计算公式如下：S（%）=（1-A样品）/A空白×100%。其中，A空白为未加药液的DPPH溶液的吸光度，A样品为加入药液的DPPH溶液的吸光度。
1.2.4羟自由基体系。
以蒸馏水将75mmo1/L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释至7.5mmol/L，依次往50mL比色管中加入1.0mL浓度7.5mmol/L邻二氮菲溶液，5mLpH7.4PBS、1.0mLFeSO4溶液、一定量的抗氧剂溶液、1.0mLH2O2应用液，以蒸馏水补充体积至25mL。37℃保温反应60min，测A510。既加抗氧剂，又加H2O2的为加药管;不加抗氧剂，只加H2O2的为损伤管;未损伤管两者均不加。羟自由基清除率s=（A加药-A损伤）/（A未损伤-A损伤）×100%。若为负值，则此时表现促氧化性;若为正值，则此时表现抗氧化性。
2结果与分析
2.1细叶石仙桃石油醚提取物总黄酮含量测定结果
细叶石仙桃石油醚提取物总黄酮含量以芦丁为对照品测定，以吸收度对溶液浓度进行回归分析，得到回归方程y=9.6778x+0.0167（R=0.9992）。根据线性方程得出细叶石仙桃石油醚提取物的总黄酮含量测定结果，其总黄酮含量为10.6mg/g。
2.2细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力
2.2.1不同浓度提取物对DPPH自由基的清除能力。
不同浓度细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力如图1所示。当药液浓度低于1.5mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率基本维持在一个水平，不同浓度提取物对DPPH自由基的清除率从高到低的顺序为：1.2mg/mL>0.8mg/mL>0.5mg/mL>1.5mg/mL>0.2mg/mL。当药液浓度高于1.5mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率增加到较高值，药液浓度为2.0mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率达到最大值。
2.2.2不同时间提取物对DPPH自由基的清除能力。
细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力与反应时间之间的关系如图2所示。将药液浓度为2.0mg/mL提取物溶液加入DPPH自由基体系中，立即吸取溶液进行清除率测定，测得DPPH自由基清除率为13.7%。在反应时间为10min时进行测定，细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力增大為反应时间0min时的1.26倍。对比提取物在反应时间10～40min的DPPH自由基清除率，发现其数值基本维持在一个水平。 2.3细叶石仙桃石油醚提取物对羟基自由基的清除能力
细叶石仙桃石油醚提取物对羟基自由基的清除能力与药液浓度之间的关系如图3所示。药液浓度对于细叶石仙桃石油醚提取物羟基自由基清除能力的影响很大，在较低浓度（小于0.5mg/mL）时，提取物羟基自由基清除率为负值，表示细叶石仙桃石油醚提取物具有促氧化作用。当药液浓度增加到0.8mg/mL，提取物羟基自由基清除率为10.3%，表现出抗氧化性。随着药液浓度增加，提取物对羟基自由基清除率增加，在药液浓度为1.2和1.5mg/mL，提取物羟基自由基清除率分别增加为0.8mg/mL药液浓度下羟基自由基清除率的6.97倍和8.75倍。
2.4细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH和羟基自由基EC50值的影响
EC50值表示抗氧化剂对自由基清除一半时所需的药液浓度，细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的EC50值为21.36mg/mL，对羟自由基的EC50值为1.05mg/mL。结果表明细叶石仙桃石油醚提取物对于羟自由基具有很强的清除能力，在很低的药液浓度就对羟自由基达到半数抑制。
3结论
测定细叶石仙桃石油醚提取物的总黄酮含量，并采用DPPH自由基体系和羟自由基体系来评估其自由基清除活性。以芦丁为对照品，测得细叶石仙桃石油醚提取物的总黄酮含量为10.6mg/g。细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基显示出良好的清除效果，药液浓度为2.0mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率达到最大值，在反应时间为10～40min，其数值基本维持在一个水平。该提取物对羟自由基具有很强的清除能力，在较高浓度时提取物对羟自由基
清除率完全。试验结果表明，细叶石仙桃石油醚提取物具有优异的自由基清除能力。
参考文献
[1]HALLIWELLB，MURCIAMA，CHIRICOS，etal.Freeradicalsandantioxidantsinfoodaninvivo：Whattheydoandhowtheywork[J].CritRevFoodSciNutr，1995，35（1/2）：7-20.
[2]SUW，LIPY，HUOLN，etal.PhenoliccontentandantioxidantactivityofPhymatopterishastate[J].JSerbChemSoc，2011，76（11）：1485-1496.
[3]TABARTJ，KEVERSC，PINCEMAILJ，etal.Antioxidantcapacityofblackcurrantvarieswithorgan，season，andcultivar[J].JAgricFoodChem，2006，54（17）：6271-6276.
[4]LIPY，HUOLN，SUW，etal.Freeradicalscavengingcapacity，antioxidantactivityandphenoliccontentofPouzolziazeylanica[J].JSerbChemSoc，2011，76（5）：709-717.
[5]MAZORD，GREENBERGL，SHAMIRD，etal.Antioxidantpropertiesofbucillamine：Possiblemodeofaction[J].BiochemBiophResCo，2006，349（3）：1171-1175.
[6]李培源，蘇炜，霍丽妮，等.黄葵籽挥发油化学成分及其抗氧化活性研究[J].时珍国医国药，2012，23（3）：603-604.
[7]李培源，卢汝梅，苏炜，等.地肤子总黄酮含量测定及其抗氧化活性[J].湖北农业科学，2016，55（7）：1802-1804.
[8]李培源，卢汝梅，苏炜，等.萆薢总黄酮含量测定及其抗氧化活性研究[J].时珍国医国药，2015，26（6）：1303-1304.
[9]李培源，霍丽妮，贾智若，等.龙胆草抗氧化活性和总黄酮含量测定研究[J].安徽农业科学，2018，46（31）：182-183.
关键词细叶石仙桃;DPPH;羟自由基;清除能力;总黄酮含量
中图分类号TS202.3文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）01-0174-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.052
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
活性氧（ROS）由自由基（如超氧阴离子和羟基自由基）和非自由基物种（如H2O2和单氧）组成，是不同形式的活性氧。ROS是由所有需氧生物产生的，并且可以容易地与包括蛋白质、脂类、lipoproteins和DNA在内的大多数生物分子发生反应。因此，充足的ROS导致各种病理生理紊乱，如关节炎、糖尿病、炎症、癌症和遗传毒性。因此，需要使用抗氧化剂来抵抗氧化应激和ROS的毒性作用[1-3]。由于合成的抗氧化剂副作用多，近年来科研工作者致力于寻找来源于植物的天然抗氧化剂[4-9]。细叶石仙桃作为一种常用的草药，其抗氧化方面的研究未见报道。通过冷浸法得到细叶石仙桃石油醚提取物，测定其总黄酮含量，并采用DPPH和羟自由基体系，评估其对自由基的清除能力。
1材料与方法
1.1仪器与材料
UV1901型紫外可见分光光度计（北京普析电子科技有限公司）。细叶石仙桃药材购于广西百色。芦丁标准品购于百灵威试剂公司（北京）。所有试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1细叶石仙桃石油醚提取物制备。
称取20g细叶石仙
桃粉末，加入200mL石油醚（95%），冷浸72h。重复上述操作3次，合并提取液。旋转蒸发回收溶剂，得到细叶石仙桃石油醚提取物。
1.2.2总黄酮含量测定。
1.2.2.1标准曲线测定。
精密吸取芦丁对照品溶液（lmg/mL）于10mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.4mL，静置6min，加入5%硝酸铝0.4mL，静置6min。加5%氢氧化钠试液4.0mL，用95%石油醚稀释至刻度，摇匀。静置15min，在510nm处测定吸收度。以吸收度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，推出回归方程。
1.2.2.2细叶石仙桃石油醚提取物总黄酮含量测定。
将芦丁标准溶液换为固定浓度提取物溶液，同上操作测定吸光度，多次测量求平均值。根据标准曲线计算总黄酮的芦丁当量，总黄酮含量以每克干物质的芦丁当量（mg）表示，并计算提取得率。
1.2.3二苯基苦味肼基自由基（DPPH）体系[4]。
取不同浓度细叶石仙桃石油醚提取物溶液（0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0mg/mL）加入8mLDPPH（0.004%）溶液中。在最大波长处（517nm）测吸光度，直到平衡为止。清除率计算公式如下：S（%）=（1-A样品）/A空白×100%。其中，A空白为未加药液的DPPH溶液的吸光度，A样品为加入药液的DPPH溶液的吸光度。
1.2.4羟自由基体系。
以蒸馏水将75mmo1/L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释至7.5mmol/L，依次往50mL比色管中加入1.0mL浓度7.5mmol/L邻二氮菲溶液，5mLpH7.4PBS、1.0mLFeSO4溶液、一定量的抗氧剂溶液、1.0mLH2O2应用液，以蒸馏水补充体积至25mL。37℃保温反应60min，测A510。既加抗氧剂，又加H2O2的为加药管;不加抗氧剂，只加H2O2的为损伤管;未损伤管两者均不加。羟自由基清除率s=（A加药-A损伤）/（A未损伤-A损伤）×100%。若为负值，则此时表现促氧化性;若为正值，则此时表现抗氧化性。
2结果与分析
2.1细叶石仙桃石油醚提取物总黄酮含量测定结果
细叶石仙桃石油醚提取物总黄酮含量以芦丁为对照品测定，以吸收度对溶液浓度进行回归分析，得到回归方程y=9.6778x+0.0167（R=0.9992）。根据线性方程得出细叶石仙桃石油醚提取物的总黄酮含量测定结果，其总黄酮含量为10.6mg/g。
2.2细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力
2.2.1不同浓度提取物对DPPH自由基的清除能力。
不同浓度细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力如图1所示。当药液浓度低于1.5mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率基本维持在一个水平，不同浓度提取物对DPPH自由基的清除率从高到低的顺序为：1.2mg/mL>0.8mg/mL>0.5mg/mL>1.5mg/mL>0.2mg/mL。当药液浓度高于1.5mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率增加到较高值，药液浓度为2.0mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率达到最大值。
2.2.2不同时间提取物对DPPH自由基的清除能力。
细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力与反应时间之间的关系如图2所示。将药液浓度为2.0mg/mL提取物溶液加入DPPH自由基体系中，立即吸取溶液进行清除率测定，测得DPPH自由基清除率为13.7%。在反应时间为10min时进行测定，细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的清除能力增大為反应时间0min时的1.26倍。对比提取物在反应时间10～40min的DPPH自由基清除率，发现其数值基本维持在一个水平。 2.3细叶石仙桃石油醚提取物对羟基自由基的清除能力
细叶石仙桃石油醚提取物对羟基自由基的清除能力与药液浓度之间的关系如图3所示。药液浓度对于细叶石仙桃石油醚提取物羟基自由基清除能力的影响很大，在较低浓度（小于0.5mg/mL）时，提取物羟基自由基清除率为负值，表示细叶石仙桃石油醚提取物具有促氧化作用。当药液浓度增加到0.8mg/mL，提取物羟基自由基清除率为10.3%，表现出抗氧化性。随着药液浓度增加，提取物对羟基自由基清除率增加，在药液浓度为1.2和1.5mg/mL，提取物羟基自由基清除率分别增加为0.8mg/mL药液浓度下羟基自由基清除率的6.97倍和8.75倍。
2.4细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH和羟基自由基EC50值的影响
EC50值表示抗氧化剂对自由基清除一半时所需的药液浓度，细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基的EC50值为21.36mg/mL，对羟自由基的EC50值为1.05mg/mL。结果表明细叶石仙桃石油醚提取物对于羟自由基具有很强的清除能力，在很低的药液浓度就对羟自由基达到半数抑制。
3结论
测定细叶石仙桃石油醚提取物的总黄酮含量，并采用DPPH自由基体系和羟自由基体系来评估其自由基清除活性。以芦丁为对照品，测得细叶石仙桃石油醚提取物的总黄酮含量为10.6mg/g。细叶石仙桃石油醚提取物对DPPH自由基显示出良好的清除效果，药液浓度为2.0mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率达到最大值，在反应时间为10～40min，其数值基本维持在一个水平。该提取物对羟自由基具有很强的清除能力，在较高浓度时提取物对羟自由基
清除率完全。试验结果表明，细叶石仙桃石油醚提取物具有优异的自由基清除能力。
参考文献
[1]HALLIWELLB，MURCIAMA，CHIRICOS，etal.Freeradicalsandantioxidantsinfoodaninvivo：Whattheydoandhowtheywork[J].CritRevFoodSciNutr，1995，35（1/2）：7-20.
[2]SUW，LIPY，HUOLN，etal.PhenoliccontentandantioxidantactivityofPhymatopterishastate[J].JSerbChemSoc，2011，76（11）：1485-1496.
[3]TABARTJ，KEVERSC，PINCEMAILJ，etal.Antioxidantcapacityofblackcurrantvarieswithorgan，season，andcultivar[J].JAgricFoodChem，2006，54（17）：6271-6276.
[4]LIPY，HUOLN，SUW，etal.Freeradicalscavengingcapacity，antioxidantactivityandphenoliccontentofPouzolziazeylanica[J].JSerbChemSoc，2011，76（5）：709-717.
[5]MAZORD，GREENBERGL，SHAMIRD，etal.Antioxidantpropertiesofbucillamine：Possiblemodeofaction[J].BiochemBiophResCo，2006，349（3）：1171-1175.
[6]李培源，蘇炜，霍丽妮，等.黄葵籽挥发油化学成分及其抗氧化活性研究[J].时珍国医国药，2012，23（3）：603-604.
[7]李培源，卢汝梅，苏炜，等.地肤子总黄酮含量测定及其抗氧化活性[J].湖北农业科学，2016，55（7）：1802-1804.
[8]李培源，卢汝梅，苏炜，等.萆薢总黄酮含量测定及其抗氧化活性研究[J].时珍国医国药，2015，26（6）：1303-1304.
[9]李培源，霍丽妮，贾智若，等.龙胆草抗氧化活性和总黄酮含量测定研究[J].安徽农业科学，2018，46（31）：182-183.