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【摘要】 目的：探讨成人哮喘与ORMDL3基因多态性的关系。方法：选取2011年6月—2012年6月在本院就诊的哮喘病患者152例作为研究对象，纳入的研究对象必须符合家族三代以上祖居在长江以南。根据患者哮喘首次发作的年龄将研究对象分为早发组和晚发组，对照组为同期在本院进行健康体检的成人。哮喘组和对照组均通过PCR技术进行ORMDL3基因多态性分析。结果：哮喘组携带TT型基因的频率和T等位基因的频率明显高于对照组（P<0.05）。早发组与晚发组携带TT型基因和T等位基因的频率比较差异无统计学意义。结论：成人哮喘与ORMDL3基因多态性有一定的相关性，ORMDL3基因TT型纯合子可能是南方成人哮喘发生的高危基因。
【关键词】 成人； 哮喘； 0RMDL3； 基因多态性； rs7216389
支气管哮喘是一种基因与环境因素共同参与的疾病。就目前的资料显示，与哮喘相关的候选基因超过100个，其中25个候选基因已得到6个以上独立研究的重复性验证，主要分布在1、2、5（6个基因）、6（4个基因）、7、11（3个基因）、12、16、17、19和20号染色体上。近年研究表明，17号染色体血清类黏蛋白1样蛋白质3（ORMDL3）基因与哮喘的发生有很强的关系[1—4]。在我国，已有少数文章报道儿童哮喘与ORMDL3基因存在相关性[5]，而且基因相关性疾病存在地域和人种的差异，基于此，笔者提出课题ORMDL3基因多态性关系与南方成人哮喘发生的相关研究，其目的是寻找ORMDL3基因与该地区成人哮喘发生的相关证据，以期能为成人哮喘的早期防治及靶向治疗提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 纳入的研究对象必须是家族三代以上祖居在长江以南的人群。哮喘组：选择2011年6月—2012年6月在本院就诊的哮喘病患者152例，其中男82例，女70例；19～65岁，平均（39.79±11.28）岁。所有患者均符合2008年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘防治指南的诊断标准[6]。同时根据患者哮喘的首次发作年龄，将14岁以前首次发病的哮喘患者定为早发组，14岁以后首次发病的为晚发组。对照组：为同期在本院的健康体检者140例，其中男75例，女65例；年龄19～70岁，平均（41.92±13.55）岁。健康体检者是均为无血缘关系的个体，均无过敏反应家族史和个人过敏反应疾病史，亦无哮喘史。哮喘组和健康对照组以及亚组之间的年龄、性别与哮喘组基本配对。以上研究对象均于研究前签署知情同意书。
1.2 仪器与试剂 DNA提取试剂，5×定性PCR buffer[成分110 mM Tris—HCl（pH 8.0），50 mM KCl，2 mM MgCl2]，限制性内切酶Nsp Ⅰ、TaqDNA聚合酶、dNTPs，后三者均由中山大学达安基因股份有限公司提供。ABI 3900台式高通量DNA合成仪，高速台式离心机（TGL—16B上海安亭科学仪器厂），ABI 9700 PCR仪，电热恒温水槽（DK—8D上海精宏实验设备有限公司），电泳仪（DYY—2C北京市六一仪器厂），核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统JD801，HEMA珠海黑马医学仪器有限公司（捷达），紫外光分光度计。
1.3 方法
1.3.3 基因型的鉴定 扩增产物经酶切产物后以2%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察结果。
1.3.4 判断标准 扩增产物只有251 bp的DNA片断为CC型；扩增产物同时有187 bp和64 bp两个DNA片断为TT型；增产物同时有187 bp、64 bp、251 bp 3个DNA片断为TC型。
1.4 统计学处理 使用SPSS 11.0软件进行统计分析，基因型和基因频率采用基因计数法，研究对象的基因分布与Hardy—Weinberg平衡完全相符，基因型和等位基因的组间比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 在哮喘组和健康对照组中，rs7216389位点不同基因分布符合Hary—weinberg遗传平衡，说明入组人群具有良好的群体性，见图1。
2.2 哮喘组与健康对照组ORMDL3基因型与等位基因频率分布见表1。
从上表可以看出，与对照组比较，哮喘组携带TT型基因的频率明显高于对照组，而对照组的TC型杂合子的频率明显高于哮喘组（ 字2=107.3，P<0.05），在两组中CC型纯合子携带频率均较低；对等位基因进行分析，哮喘组出现T等位基因的频率也高于对照组（ 字2=30，P<0.05）。早发组哮喘患者与健康对照组进行比较，携带TT型基因的频率仍明显高于对照组（ 字2=60.3，P<0.05）；晚发组哮喘患者与健康对照组进行比较，得出同样的结果（ 字2=51.7，P<0.05），两亚组T等位基因的频率也明显高于健康对照组（ 字2值分别为17.4和15.3，P<0.05）。早发组与晚发组比较，两亚组携带TT型基因和T等位基因的频率没有任何差异（ 字2值分别为0.053和0.0011，P>0.05）。
3 讨论
哮喘是一种受环境因素影响的多基因遗传性疾病，在具有不同遗传背景的人群中可能存在不同的哮喘易感基因，基于这一点，参考以前报道的文献[1—4]，笔者选择祖居三代以上的长江以南的南方人群作为研究对象，对其进行ORMDL3基因多态性分析。结果发现，哮喘组TT型纯合子的明显高于对照组，哮喘组携带T等位基因的频率也高于对照组，但是携带T等位基因的TC型杂合子在健康对照组中的频率明显高于哮喘组，笔者推测C等位基因可能是哮喘的保护基因，因而明显降低TC型杂合子哮喘的发生率。由于有研究显示，儿童哮喘和成人哮喘的病因、诱因以及基因可能存在差别[7]，所以笔者根据患者哮喘首次发作年龄的不同，将哮喘组的研究对象划分早发组和晚发组，以探索在幼年就开始发病的成人哮喘与成年后开始发病的成人哮喘在ORMDL3基因多态性分布上是否存在差异。对两组人群的基因型和等位基因的分布特点分别进行分析，得出了以上的同样结果，因而可以认为，尽管成人哮喘的发生比儿童受到更多的后天环境因素的影响，但携带ORMDL3 TT型基因的人群仍然是更容易发生哮喘。在这组人群中，CC型纯合子比较少，根据这个结果笔者认为，TT型ORMDL3基因可能是哮喘发生的高危基因，但TC型杂合子并不能增加哮喘发生的危险性。 ORMDL3基因位于染色体17q12—q2，编码一个由153个氨基酸组成的位于内质网膜的跨膜蛋白（NP_644809），调节内质网介导的钙离子信号和细胞压力，内质网内钙离子水平促使未折叠蛋白质应答，从而作为内源性介质诱导炎症发生，因此，ORMDL3基因可能是一个促炎症基因。笔者推测，在rs7216389位点基因系列的不同，对ORMDL3基因表达影响也不同，进而影响个体哮喘发生的易感性也不同。这种相关性的明确机制目前还不清楚，有待进一步研究。
根据实验结果笔者认为，ORMDL3基因TT型纯合子可能是南方成人哮喘发生的高危基因，由于本次研究的样本数有限，需待进一步进行大样本、多个地域以及多个民族广泛的协同研究，以提高研究结果的科学性，为哮喘的风险预测、防治和治疗提供一条新的线索和途径。
参考文献
[1] Moffatt M F， Kabesch M， Liang L， et al. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma[J]. Nature，2007，448（7152）：470—473.
[2] Leung T F， Sy H Y， Ng M C， et al. Asthma and atopy are associated with chromosome 17q21 markers in Chinese children[J]. Allergy，2009，64（4）：621—628.
[3] Hirota T， Harada M， Sakashita M， et al. Genetic polymorphism regulating ORM1—like3（Saccharomy cescerevisiac） expression is associated with childhood atropic asthma Japanese population[J]. Clin Immunol，2008，121（4）：769—770.
[4] Tavendale R， Macgregor D F， Mukhopadhyay S， et al. A polymorphism controlling ORMDL3 expression is associated with asthma that is poorly controlled by current medications[J]. J Allergy Clin lmmunol，2008，121（4）：860—863.
[5] 孙婧，李乔俊，徐飞，等.儿童哮喘与ORMDL3基因多态性关系的研究[J].中国康复理论与实践，2010，16（4）：361—363.
[6] 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志，2008，31（3）：177—185.
[7] Moffatt M F， Gut I G， Demenais F， et al. A large—scale， ansortum—based genomewide association study of asthma[J]. N Enql J Med，2010，363（3）：1211—1221.
（收稿日期：2012—07—16） （本文编辑：王宇）
【关键词】 成人； 哮喘； 0RMDL3； 基因多态性； rs7216389
支气管哮喘是一种基因与环境因素共同参与的疾病。就目前的资料显示，与哮喘相关的候选基因超过100个，其中25个候选基因已得到6个以上独立研究的重复性验证，主要分布在1、2、5（6个基因）、6（4个基因）、7、11（3个基因）、12、16、17、19和20号染色体上。近年研究表明，17号染色体血清类黏蛋白1样蛋白质3（ORMDL3）基因与哮喘的发生有很强的关系[1—4]。在我国，已有少数文章报道儿童哮喘与ORMDL3基因存在相关性[5]，而且基因相关性疾病存在地域和人种的差异，基于此，笔者提出课题ORMDL3基因多态性关系与南方成人哮喘发生的相关研究，其目的是寻找ORMDL3基因与该地区成人哮喘发生的相关证据，以期能为成人哮喘的早期防治及靶向治疗提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 纳入的研究对象必须是家族三代以上祖居在长江以南的人群。哮喘组：选择2011年6月—2012年6月在本院就诊的哮喘病患者152例，其中男82例，女70例；19～65岁，平均（39.79±11.28）岁。所有患者均符合2008年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘防治指南的诊断标准[6]。同时根据患者哮喘的首次发作年龄，将14岁以前首次发病的哮喘患者定为早发组，14岁以后首次发病的为晚发组。对照组：为同期在本院的健康体检者140例，其中男75例，女65例；年龄19～70岁，平均（41.92±13.55）岁。健康体检者是均为无血缘关系的个体，均无过敏反应家族史和个人过敏反应疾病史，亦无哮喘史。哮喘组和健康对照组以及亚组之间的年龄、性别与哮喘组基本配对。以上研究对象均于研究前签署知情同意书。
1.2 仪器与试剂 DNA提取试剂，5×定性PCR buffer[成分110 mM Tris—HCl（pH 8.0），50 mM KCl，2 mM MgCl2]，限制性内切酶Nsp Ⅰ、TaqDNA聚合酶、dNTPs，后三者均由中山大学达安基因股份有限公司提供。ABI 3900台式高通量DNA合成仪，高速台式离心机（TGL—16B上海安亭科学仪器厂），ABI 9700 PCR仪，电热恒温水槽（DK—8D上海精宏实验设备有限公司），电泳仪（DYY—2C北京市六一仪器厂），核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统JD801，HEMA珠海黑马医学仪器有限公司（捷达），紫外光分光度计。
1.3 方法
1.3.3 基因型的鉴定 扩增产物经酶切产物后以2%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察结果。
1.3.4 判断标准 扩增产物只有251 bp的DNA片断为CC型；扩增产物同时有187 bp和64 bp两个DNA片断为TT型；增产物同时有187 bp、64 bp、251 bp 3个DNA片断为TC型。
1.4 统计学处理 使用SPSS 11.0软件进行统计分析，基因型和基因频率采用基因计数法，研究对象的基因分布与Hardy—Weinberg平衡完全相符，基因型和等位基因的组间比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 在哮喘组和健康对照组中，rs7216389位点不同基因分布符合Hary—weinberg遗传平衡，说明入组人群具有良好的群体性，见图1。
2.2 哮喘组与健康对照组ORMDL3基因型与等位基因频率分布见表1。
从上表可以看出，与对照组比较，哮喘组携带TT型基因的频率明显高于对照组，而对照组的TC型杂合子的频率明显高于哮喘组（ 字2=107.3，P<0.05），在两组中CC型纯合子携带频率均较低；对等位基因进行分析，哮喘组出现T等位基因的频率也高于对照组（ 字2=30，P<0.05）。早发组哮喘患者与健康对照组进行比较，携带TT型基因的频率仍明显高于对照组（ 字2=60.3，P<0.05）；晚发组哮喘患者与健康对照组进行比较，得出同样的结果（ 字2=51.7，P<0.05），两亚组T等位基因的频率也明显高于健康对照组（ 字2值分别为17.4和15.3，P<0.05）。早发组与晚发组比较，两亚组携带TT型基因和T等位基因的频率没有任何差异（ 字2值分别为0.053和0.0011，P>0.05）。
3 讨论
哮喘是一种受环境因素影响的多基因遗传性疾病，在具有不同遗传背景的人群中可能存在不同的哮喘易感基因，基于这一点，参考以前报道的文献[1—4]，笔者选择祖居三代以上的长江以南的南方人群作为研究对象，对其进行ORMDL3基因多态性分析。结果发现，哮喘组TT型纯合子的明显高于对照组，哮喘组携带T等位基因的频率也高于对照组，但是携带T等位基因的TC型杂合子在健康对照组中的频率明显高于哮喘组，笔者推测C等位基因可能是哮喘的保护基因，因而明显降低TC型杂合子哮喘的发生率。由于有研究显示，儿童哮喘和成人哮喘的病因、诱因以及基因可能存在差别[7]，所以笔者根据患者哮喘首次发作年龄的不同，将哮喘组的研究对象划分早发组和晚发组，以探索在幼年就开始发病的成人哮喘与成年后开始发病的成人哮喘在ORMDL3基因多态性分布上是否存在差异。对两组人群的基因型和等位基因的分布特点分别进行分析，得出了以上的同样结果，因而可以认为，尽管成人哮喘的发生比儿童受到更多的后天环境因素的影响，但携带ORMDL3 TT型基因的人群仍然是更容易发生哮喘。在这组人群中，CC型纯合子比较少，根据这个结果笔者认为，TT型ORMDL3基因可能是哮喘发生的高危基因，但TC型杂合子并不能增加哮喘发生的危险性。 ORMDL3基因位于染色体17q12—q2，编码一个由153个氨基酸组成的位于内质网膜的跨膜蛋白（NP_644809），调节内质网介导的钙离子信号和细胞压力，内质网内钙离子水平促使未折叠蛋白质应答，从而作为内源性介质诱导炎症发生，因此，ORMDL3基因可能是一个促炎症基因。笔者推测，在rs7216389位点基因系列的不同，对ORMDL3基因表达影响也不同，进而影响个体哮喘发生的易感性也不同。这种相关性的明确机制目前还不清楚，有待进一步研究。
根据实验结果笔者认为，ORMDL3基因TT型纯合子可能是南方成人哮喘发生的高危基因，由于本次研究的样本数有限，需待进一步进行大样本、多个地域以及多个民族广泛的协同研究，以提高研究结果的科学性，为哮喘的风险预测、防治和治疗提供一条新的线索和途径。
参考文献
[1] Moffatt M F， Kabesch M， Liang L， et al. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma[J]. Nature，2007，448（7152）：470—473.
[2] Leung T F， Sy H Y， Ng M C， et al. Asthma and atopy are associated with chromosome 17q21 markers in Chinese children[J]. Allergy，2009，64（4）：621—628.
[3] Hirota T， Harada M， Sakashita M， et al. Genetic polymorphism regulating ORM1—like3（Saccharomy cescerevisiac） expression is associated with childhood atropic asthma Japanese population[J]. Clin Immunol，2008，121（4）：769—770.
[4] Tavendale R， Macgregor D F， Mukhopadhyay S， et al. A polymorphism controlling ORMDL3 expression is associated with asthma that is poorly controlled by current medications[J]. J Allergy Clin lmmunol，2008，121（4）：860—863.
[5] 孙婧，李乔俊，徐飞，等.儿童哮喘与ORMDL3基因多态性关系的研究[J].中国康复理论与实践，2010，16（4）：361—363.
[6] 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志，2008，31（3）：177—185.
[7] Moffatt M F， Gut I G， Demenais F， et al. A large—scale， ansortum—based genomewide association study of asthma[J]. N Enql J Med，2010，363（3）：1211—1221.
（收稿日期：2012—07—16） （本文编辑：王宇）