论文部分内容阅读
【摘要】 目的：探讨眼镜蛇毒细胞毒素(Cytotoxin，CTX)对S180 荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。方法：采用昆明小鼠S180实体瘤模型，通过腹腔注射CTX，观察CTX 对S180小鼠的肿瘤重量、亚显微结构、凋亡率和pro-caspase-3表达量的变化。结果：CTX 对S180肿瘤细胞的生长表现出明显抑制作用。0.2、0.4、0.8 mg/kg CTX剂量组的抑瘤率分别为23.8%、54.1%、63.2%；透射电子显微镜和流式细胞仪检测显示S180肿瘤细胞发生凋亡；免疫印迹结果显示pro-caspase-3蛋白表达降低，提示caspase-3被激活。结论：CTX 通过诱导细胞凋亡来抑制S180肿瘤细胞的生长。
【关键词】 眼镜蛇毒； 细胞毒素； S180； 凋亡； caspase-3
眼镜蛇毒细胞毒素(Cytotoxin，CTX)又称为心脏毒素(Cobra Cardiotoxin)，是眼镜蛇毒的主要毒性组分之一，其主要成分为蛋白质和多肽。CTX的氨基酸残基总数为60~63个，含4对二硫键，分子量为6000~7000 Da，是一类含有大量疏水氨基酸残基的强碱性多肽[1-2]。国内外研究证实，CTX不仅对体外培养的各种肿瘤细胞株有杀伤作用[3-4]，而且也能抑制体内肿瘤细胞的生长[4-5]，但其作用机制尚未清楚。本论文通过免疫印迹检测凋亡相关蛋白caspase-3的表达，从而探讨CTX抑制S180荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长是否与caspase途径有关，为今后的临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 动物 1月龄昆明小鼠购自广东省实验动物中心(许可证号SCXK粤 2008-0002)，雄雌各半，体重(20±2)g。
1.2 细胞株 S180 瘤株由中山大学医学院细胞中心提供。
1.3 药物 由广州医学院蛇毒研究所提供。
1.4 试剂与仪器 环磷酰胺(Sigma，USA)；caspase-3抗体(cell singal公司)；鼠抗人Actin抗体(newmarker公司)；PVDF膜(威佳公司)；Annexin-V/PI双染试剂盒(凯基公司)；透射电镜(CM10 Philips， Mahwah， NJ)；流式细胞仪：Coulter， USA；蛋白转移电泳槽(PowerPac Basic， Bio-Rad， USA)。
1.5 模型的制备 S180 肿瘤细胞在小鼠腹腔内稳定传2代后，无菌条件下抽取生长良好的乳白色腹水，用生理盐水稀释至1×107个/ml，以0.2 ml/只接种于小鼠前肢右侧腋下皮下。
1.6 分组和给药方法 小鼠适应性饲养7 d后进行接种。肿瘤接种后小鼠称重，并按体重大小随机分为五组，每组10只，分别为荷瘤对照组、环磷酰胺组、CTX低剂量组、CTX中剂量组和CTX高剂量组。接种S180细胞24 h后，荷瘤对照组腹腔注射0.1 ml生理盐水；环磷酰胺组腹腔注射30 mg/kg环磷酰胺0.1 ml；CTX低、中、高剂量组分别以0.2、0.4、0.8 mg/kg 腹腔给药。1 次/d，0.1 ml/次，连续给药12 d。于停药次日，颈椎脱臼处死小鼠。剥离小鼠腋下皮下瘤体，称肿瘤重量。按下列公式计算抑瘤率(%)=[A-B/A]×100%，A代表对照组瘤重，B代表处理组瘤重。
1.6 透镜电镜观察CTX对S180 荷瘤小鼠的亚显微结构的影响 取荷瘤对照组和CTX中剂量组的S180肿瘤组织，用2.5%戊二醛预固定，1% 锇酸后固定，环氧树酯包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双染色，透射电镜观察各组肿瘤细胞的形态。
1.7 Annexin-V/PI双染检测凋亡率 用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织，然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织，边搓边滴入PBS缓冲液。然后用PBS洗涤细胞两次，加入500 μl的Binding Buffer悬浮调整细胞浓度为1×106/ ml。最后分别加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光、室温反应15 min后，用流式细胞仪检测凋亡率。
1.8 免疫印迹法检测 用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织，然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织，边搓边滴入PBS缓冲液。用PBS洗涤细胞两次，提取蛋白：每106个细胞依次加入300 μl RIPA蛋白裂解液及3 μl PMSF (phenylmethysulfonyl fluoride) 溶液，用200 μl枪头吸打混匀，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 ×g 离心30 min。将上清移至新管，BCA法测定蛋白含量。
SDS-PAGE 凝胶电泳：配制12 %的分离胶与5%浓缩胶，灌胶，待胶聚合完全，将准备好的样品液和预染Marker 分别上样，使用BioRad 电泳装置，80V 恒压电泳15 min，120 V 恒压电泳70 min。转膜300 mA 1 h，转移完成后取出膜，切角做标记。加5%的脱脂奶粉封闭孵育膜，室温摇床振荡l h。加一抗(稀释度1∶1000 )，室温摇床孵育2 h。PBST洗膜，15 min×3 次，加HRP 标记的二抗(稀释度1:8000 )，室温摇床孵育l h，PBST 洗膜，15 min×3 次，进行化学发光检测。
1.9 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件分析，实验数据用(x±s)表示，进行方差分析、q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 CTX 对肿瘤重量的抑制作用随剂量增加而增加，CTX低、中、高剂量组的肿瘤重量都明显低于荷瘤对照组(P<0.05)。CTX低、中、高剂量组肿瘤重量的抑瘤率分别为23.8%、54.1%、63.2%。见图1。
注：A为荷瘤对照组和处理组的肿瘤重量；B为肿瘤重量的抑制率。与荷瘤对照组比较，*P< 0.05，**P<0.01 2.2 CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤细胞亚显微结构的影响 连续给药12 d后，剥离肿瘤组织，透射电镜观察细胞的亚显微结构。荷瘤对照组的肿瘤细胞，其核膜和核仁结构清晰，染色质分布均匀，说明细胞生长良好(图2A)；而CTX中剂量组小鼠的肿瘤细胞，其染色质发生浓缩，聚集在核膜边缘，线粒体出现不同程度的膨胀，甚至空泡化，呈现明显的凋亡特征(图2B)。
图2 透射电镜观察CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤细胞形态的影响
注：A为荷瘤对照组(10000×)；B为中剂量CTX组(9000×)
2.3 CTX对小鼠体内S180 细胞的凋亡影响 为了进一步证实CTX所诱导的凋亡，笔者用Annexin V/ PI双染法来检测凋亡率。由图3可见，荷瘤对照组，CTX低、中、高剂量组的早期凋亡率分别为7.9%、15.8%、30.1%和20.4%，而晚期凋亡率则从15.6%增加到47.8%，提示CTX诱导的细胞凋亡涉及其抗肿瘤效果。
2.4 CTX对小鼠体内S180 细胞caspase-3蛋白表达的影响 为了研究CTX所诱导的S180细胞凋亡是否依赖caspase途径，笔者检测了caspase-3蛋白的表达。免疫印迹杂交结果显示，与荷瘤对照组比较，CTX低、中、高剂量组的caspase-3蛋白酶原表达降低，提示caspase-3被剪切活化。见图4。
3 讨论
眼镜蛇毒细胞毒素是从中华眼镜蛇毒中提取纯化的一种生物活性物质，国内外学者发现其对体内外的多种肿瘤细胞有直接的杀伤作用[3-5]，但具体的作用机制尚未清楚。目前认为，蛇毒的抗肿瘤作用可能与细胞膜磷脂成分相互作用、干扰膜转运机制、与膜受体作用、干扰肿瘤细胞的DNA复制和诱导肿瘤细胞发生凋亡有关[6]。研究表明，蛇毒中的出血毒素能诱导血管内皮细胞凋亡[7]；来自眼镜蛇毒的神经毒素Ⅱ能诱导白血病K562和L929细胞的凋亡[8]。但很少有CTX诱导肿瘤细胞凋亡的报道。
本研究用三种不同剂量的CTX作用于小鼠体内S180肿瘤细胞，结果表明，低、中、高剂量组都对体内肿瘤细胞的生长有不同程度的抑制作用，且随着CTX浓度的增大，抑瘤率也越大，CTX中、高剂量组的肿瘤重量显著低于对照组(P<0.01)。在透射电子显微镜下，经过CTX处理过的S180细胞具有明显的凋亡特征，如染色质浓缩、线粒体空泡化；Annexin V/ PI双染检测也证实S180发生了凋亡。通过免疫印迹杂交实验，笔者检测了pro-caspase-3蛋白的表达，结果发现pro-caspase-3的表达量下降，提示CTX通过激活caspase-3来诱导S180细胞发生凋亡。
凋亡的信号途径主要有两种类型：外在途径，也称为死亡受体途径；内在途径，也称为线粒体途径。他们在不同的通路发挥作用，但最终都会导致凋亡的效应蛋白caspase-3，-6 或-7的激活[9]，从而激活核酸内切酶，使染色质发生浓缩，形成凋亡小体[10]。此研究也表明，CTX所诱导的细胞凋亡途径是一种caspase依赖性途径。
目前，临床上已经用蛇毒来治疗各种中、晚期癌症患者，提高患者的生活质量，延长生存期[11]。我国有丰富的蛇毒资源，因此将CTX开发成为安全有效、长期使用的抗肿瘤药物有着广阔的前景和深刻的意义。
参考文献
[1] Lin S R，Chang L S，Chang K L.Separation and structure function studies of Taiwan cobra cardiotoxins[J].J Protein Chem，2002，21(2)：81-86.
[2] 颜汝平，王剑松，徐鸿毅.蛇毒膜毒素抗肿瘤机制的研究进展[J].云南医药，2007，28(4)：404-407.
[3] 丁明霞，王剑松，王婉瑜，等.中华眼镜蛇毒细胞毒素体外抑制膀胱癌细胞增殖活性的实验性研究[J].昆明医学院学报，2006，4(6)：6-10.
[4] 雷丹青，刘绵林，蓝利，等.广西眼镜蛇蛇毒细胞毒素的抗肿瘤作用[J].实用癌症杂志，2004，19(2)：127-129.
[5] Abu-Sinna G， Esmat A Y， Al-Zahaby A A， et al. Fractionation and characterization of Cerastes cerastes cerastes snake venom and the antitumor action of its lethal and non-lethal fractions [J].Toxicon，2003，42(15)：207-215.
[6] 罗格莲.眼镜蛇毒细胞毒素抗肿瘤作用的研究及进展[J].海峡药学，2007，19(11)：4-7.
[7] Suzuki K，Nakamura M，Hatanaka Y，et al.Induction of apoptotic cell death in human endothelial cells treated with snake venom： implication of intracellular reactive oxygen species and protective effects of glutathione and superoxide dismutases[J].J Biochem，1997， 122(6)：1260-1264.
[8] Strizhkov B N，Blishchenko E Y，Satpaev D K，et al.Both neurotoxin II from venom of Naja naja oxiana and its endogenous analogue induce apoptosis in tumor cells[J]. FEBS Lett，1994，340(1-2)：22-24.
[9] Lin M L，Lu Y C，Chung J G，et al.Aloe-emodin induces apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cells via caspase-8-mediated activation of the mitochondrial death pathway[J].Cancer Lett，2009，291(24)：46-58.
[10] Trisciuoglio D，Uranchimeg B，Cardellina J H，et al. Induction of apoptosis in human cancer cells by candidaspongiolide， a novel sponge polyketide[J].J Natl Cancer Inst，2008，100(12)：1233-1246.
[11] Cura J E，Blanzaco D P，Brisson C，et al. Phase 1 and pharmacokineties study of crotoxin in patients with advanced cancer[J].Clin Cancer Res，2002，8(4)：1033-1041.
(收稿日期：2012-04-09) (本文编辑：陈丹云)
【关键词】 眼镜蛇毒； 细胞毒素； S180； 凋亡； caspase-3
眼镜蛇毒细胞毒素(Cytotoxin，CTX)又称为心脏毒素(Cobra Cardiotoxin)，是眼镜蛇毒的主要毒性组分之一，其主要成分为蛋白质和多肽。CTX的氨基酸残基总数为60~63个，含4对二硫键，分子量为6000~7000 Da，是一类含有大量疏水氨基酸残基的强碱性多肽[1-2]。国内外研究证实，CTX不仅对体外培养的各种肿瘤细胞株有杀伤作用[3-4]，而且也能抑制体内肿瘤细胞的生长[4-5]，但其作用机制尚未清楚。本论文通过免疫印迹检测凋亡相关蛋白caspase-3的表达，从而探讨CTX抑制S180荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长是否与caspase途径有关，为今后的临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 动物 1月龄昆明小鼠购自广东省实验动物中心(许可证号SCXK粤 2008-0002)，雄雌各半，体重(20±2)g。
1.2 细胞株 S180 瘤株由中山大学医学院细胞中心提供。
1.3 药物 由广州医学院蛇毒研究所提供。
1.4 试剂与仪器 环磷酰胺(Sigma，USA)；caspase-3抗体(cell singal公司)；鼠抗人Actin抗体(newmarker公司)；PVDF膜(威佳公司)；Annexin-V/PI双染试剂盒(凯基公司)；透射电镜(CM10 Philips， Mahwah， NJ)；流式细胞仪：Coulter， USA；蛋白转移电泳槽(PowerPac Basic， Bio-Rad， USA)。
1.5 模型的制备 S180 肿瘤细胞在小鼠腹腔内稳定传2代后，无菌条件下抽取生长良好的乳白色腹水，用生理盐水稀释至1×107个/ml，以0.2 ml/只接种于小鼠前肢右侧腋下皮下。
1.6 分组和给药方法 小鼠适应性饲养7 d后进行接种。肿瘤接种后小鼠称重，并按体重大小随机分为五组，每组10只，分别为荷瘤对照组、环磷酰胺组、CTX低剂量组、CTX中剂量组和CTX高剂量组。接种S180细胞24 h后，荷瘤对照组腹腔注射0.1 ml生理盐水；环磷酰胺组腹腔注射30 mg/kg环磷酰胺0.1 ml；CTX低、中、高剂量组分别以0.2、0.4、0.8 mg/kg 腹腔给药。1 次/d，0.1 ml/次，连续给药12 d。于停药次日，颈椎脱臼处死小鼠。剥离小鼠腋下皮下瘤体，称肿瘤重量。按下列公式计算抑瘤率(%)=[A-B/A]×100%，A代表对照组瘤重，B代表处理组瘤重。
1.6 透镜电镜观察CTX对S180 荷瘤小鼠的亚显微结构的影响 取荷瘤对照组和CTX中剂量组的S180肿瘤组织，用2.5%戊二醛预固定，1% 锇酸后固定，环氧树酯包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双染色，透射电镜观察各组肿瘤细胞的形态。
1.7 Annexin-V/PI双染检测凋亡率 用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织，然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织，边搓边滴入PBS缓冲液。然后用PBS洗涤细胞两次，加入500 μl的Binding Buffer悬浮调整细胞浓度为1×106/ ml。最后分别加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光、室温反应15 min后，用流式细胞仪检测凋亡率。
1.8 免疫印迹法检测 用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织，然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织，边搓边滴入PBS缓冲液。用PBS洗涤细胞两次，提取蛋白：每106个细胞依次加入300 μl RIPA蛋白裂解液及3 μl PMSF (phenylmethysulfonyl fluoride) 溶液，用200 μl枪头吸打混匀，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 ×g 离心30 min。将上清移至新管，BCA法测定蛋白含量。
SDS-PAGE 凝胶电泳：配制12 %的分离胶与5%浓缩胶，灌胶，待胶聚合完全，将准备好的样品液和预染Marker 分别上样，使用BioRad 电泳装置，80V 恒压电泳15 min，120 V 恒压电泳70 min。转膜300 mA 1 h，转移完成后取出膜，切角做标记。加5%的脱脂奶粉封闭孵育膜，室温摇床振荡l h。加一抗(稀释度1∶1000 )，室温摇床孵育2 h。PBST洗膜，15 min×3 次，加HRP 标记的二抗(稀释度1:8000 )，室温摇床孵育l h，PBST 洗膜，15 min×3 次，进行化学发光检测。
1.9 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件分析，实验数据用(x±s)表示，进行方差分析、q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 CTX 对肿瘤重量的抑制作用随剂量增加而增加，CTX低、中、高剂量组的肿瘤重量都明显低于荷瘤对照组(P<0.05)。CTX低、中、高剂量组肿瘤重量的抑瘤率分别为23.8%、54.1%、63.2%。见图1。
注：A为荷瘤对照组和处理组的肿瘤重量；B为肿瘤重量的抑制率。与荷瘤对照组比较，*P< 0.05，**P<0.01 2.2 CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤细胞亚显微结构的影响 连续给药12 d后，剥离肿瘤组织，透射电镜观察细胞的亚显微结构。荷瘤对照组的肿瘤细胞，其核膜和核仁结构清晰，染色质分布均匀，说明细胞生长良好(图2A)；而CTX中剂量组小鼠的肿瘤细胞，其染色质发生浓缩，聚集在核膜边缘，线粒体出现不同程度的膨胀，甚至空泡化，呈现明显的凋亡特征(图2B)。
图2 透射电镜观察CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤细胞形态的影响
注：A为荷瘤对照组(10000×)；B为中剂量CTX组(9000×)
2.3 CTX对小鼠体内S180 细胞的凋亡影响 为了进一步证实CTX所诱导的凋亡，笔者用Annexin V/ PI双染法来检测凋亡率。由图3可见，荷瘤对照组，CTX低、中、高剂量组的早期凋亡率分别为7.9%、15.8%、30.1%和20.4%，而晚期凋亡率则从15.6%增加到47.8%，提示CTX诱导的细胞凋亡涉及其抗肿瘤效果。
2.4 CTX对小鼠体内S180 细胞caspase-3蛋白表达的影响 为了研究CTX所诱导的S180细胞凋亡是否依赖caspase途径，笔者检测了caspase-3蛋白的表达。免疫印迹杂交结果显示，与荷瘤对照组比较，CTX低、中、高剂量组的caspase-3蛋白酶原表达降低，提示caspase-3被剪切活化。见图4。
3 讨论
眼镜蛇毒细胞毒素是从中华眼镜蛇毒中提取纯化的一种生物活性物质，国内外学者发现其对体内外的多种肿瘤细胞有直接的杀伤作用[3-5]，但具体的作用机制尚未清楚。目前认为，蛇毒的抗肿瘤作用可能与细胞膜磷脂成分相互作用、干扰膜转运机制、与膜受体作用、干扰肿瘤细胞的DNA复制和诱导肿瘤细胞发生凋亡有关[6]。研究表明，蛇毒中的出血毒素能诱导血管内皮细胞凋亡[7]；来自眼镜蛇毒的神经毒素Ⅱ能诱导白血病K562和L929细胞的凋亡[8]。但很少有CTX诱导肿瘤细胞凋亡的报道。
本研究用三种不同剂量的CTX作用于小鼠体内S180肿瘤细胞，结果表明，低、中、高剂量组都对体内肿瘤细胞的生长有不同程度的抑制作用，且随着CTX浓度的增大，抑瘤率也越大，CTX中、高剂量组的肿瘤重量显著低于对照组(P<0.01)。在透射电子显微镜下，经过CTX处理过的S180细胞具有明显的凋亡特征，如染色质浓缩、线粒体空泡化；Annexin V/ PI双染检测也证实S180发生了凋亡。通过免疫印迹杂交实验，笔者检测了pro-caspase-3蛋白的表达，结果发现pro-caspase-3的表达量下降，提示CTX通过激活caspase-3来诱导S180细胞发生凋亡。
凋亡的信号途径主要有两种类型：外在途径，也称为死亡受体途径；内在途径，也称为线粒体途径。他们在不同的通路发挥作用，但最终都会导致凋亡的效应蛋白caspase-3，-6 或-7的激活[9]，从而激活核酸内切酶，使染色质发生浓缩，形成凋亡小体[10]。此研究也表明，CTX所诱导的细胞凋亡途径是一种caspase依赖性途径。
目前，临床上已经用蛇毒来治疗各种中、晚期癌症患者，提高患者的生活质量，延长生存期[11]。我国有丰富的蛇毒资源，因此将CTX开发成为安全有效、长期使用的抗肿瘤药物有着广阔的前景和深刻的意义。
参考文献
[1] Lin S R，Chang L S，Chang K L.Separation and structure function studies of Taiwan cobra cardiotoxins[J].J Protein Chem，2002，21(2)：81-86.
[2] 颜汝平，王剑松，徐鸿毅.蛇毒膜毒素抗肿瘤机制的研究进展[J].云南医药，2007，28(4)：404-407.
[3] 丁明霞，王剑松，王婉瑜，等.中华眼镜蛇毒细胞毒素体外抑制膀胱癌细胞增殖活性的实验性研究[J].昆明医学院学报，2006，4(6)：6-10.
[4] 雷丹青，刘绵林，蓝利，等.广西眼镜蛇蛇毒细胞毒素的抗肿瘤作用[J].实用癌症杂志，2004，19(2)：127-129.
[5] Abu-Sinna G， Esmat A Y， Al-Zahaby A A， et al. Fractionation and characterization of Cerastes cerastes cerastes snake venom and the antitumor action of its lethal and non-lethal fractions [J].Toxicon，2003，42(15)：207-215.
[6] 罗格莲.眼镜蛇毒细胞毒素抗肿瘤作用的研究及进展[J].海峡药学，2007，19(11)：4-7.
[7] Suzuki K，Nakamura M，Hatanaka Y，et al.Induction of apoptotic cell death in human endothelial cells treated with snake venom： implication of intracellular reactive oxygen species and protective effects of glutathione and superoxide dismutases[J].J Biochem，1997， 122(6)：1260-1264.
[8] Strizhkov B N，Blishchenko E Y，Satpaev D K，et al.Both neurotoxin II from venom of Naja naja oxiana and its endogenous analogue induce apoptosis in tumor cells[J]. FEBS Lett，1994，340(1-2)：22-24.
[9] Lin M L，Lu Y C，Chung J G，et al.Aloe-emodin induces apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cells via caspase-8-mediated activation of the mitochondrial death pathway[J].Cancer Lett，2009，291(24)：46-58.
[10] Trisciuoglio D，Uranchimeg B，Cardellina J H，et al. Induction of apoptosis in human cancer cells by candidaspongiolide， a novel sponge polyketide[J].J Natl Cancer Inst，2008，100(12)：1233-1246.
[11] Cura J E，Blanzaco D P，Brisson C，et al. Phase 1 and pharmacokineties study of crotoxin in patients with advanced cancer[J].Clin Cancer Res，2002，8(4)：1033-1041.
(收稿日期：2012-04-09) (本文编辑：陈丹云)