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【摘要】 目的 探讨阿托伐他汀对糖尿病肾病大鼠肾小球细胞增殖的影响及意义。方法 将40只SD雌性大鼠随机分为四组：糖尿病肾病组（DN组）、预防组、治疗组、对照组，每组10只。DN组、预防组和治疗组糖尿病造模成功后，预防组和治疗组分别给予不同剂量的阿托伐他汀干预，对照组仅注射柠檬酸缓冲液。第8周测定相关生化指标，观察肾组织病理改变后，通过免疫组化法分析大鼠肾小球增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表达。结果 预防组和治疗组相关生化指标较DN组好转，肾脏病变减轻，PCNA表达于肾小球固有细胞。DN组肾小球中PCNA的表达均较预防组、治疗组、对照组明显上调。而预防组、治疗组肾小球中PCNA的表达较DN组下调，且预防组PCNA的下调更为显著。结论 阿托伐他汀通过下调肾小球PCNA表达，抑制肾小球细胞增殖实现对DN的保护作用。
【关键词】 阿托伐他汀；糖尿病肾病；肾小球；细胞增殖
糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的严重并发症，最终进展至慢性肾功能衰竭，也是导致糖尿病患者死亡的常见原因。因此，对DN的早期治疗以延缓慢性肾脏病的进展成为临床上需要迫切解决的关键问题。阿托伐他汀是以氟苯取代吲哚环的甲羟戊酸内酯的衍生物，是全人工合成的第2个他汀类药物，无需代谢转化就具有药理活性。近年研究发现他汀类药物的肾保护作用可能材料与方法
1.糖尿病肾病大鼠模型的建立 清洁级SD雌性大鼠40只购自广西医科大学，体重在200～250 g之间，采用随机原则分为四组：糖尿病肾病组（DN组）、预防组、治疗组和对照组，每组10只。大鼠在SPF级清洁条件下饲养。DN组、预防组和治疗组均单次左下腹腔注射50 mg/kg的链尿佐菌素（STZ），注射后连续三天采集尾静脉血测血糖浓度，若血糖>16.7 mmol/L说明糖尿病造模成功。预防组于造模成功后每天给予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；治疗组于造模成功后收集24小时尿测定尿蛋白，出现明显蛋白尿（即第4周）起每天给予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；对照组仅予注射pH=4.5的柠檬酸缓冲液。
2.标本收集 第8周用代谢笼收集大鼠24小时尿液以测定尿白蛋白排泄率（Urinary Albumin Excretion Rate，UAER），麻醉方式采用乙醚吸入，经心脏取血，离心取血清用以测定血胆固醇（CHO）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），计算内生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate，Ccr）；切下肾脏，分离包膜后用10%甲醛浸泡固定，制作石蜡块，以行常规染色、免疫组化等检测。
3.光镜下分析肾脏病理改变 肾组织蜡块行3 mm切片后行HE、PAS染色，于光镜下用彩色病理图像分析系统分析肾脏病理改变。
4.免疫组化检测 采用免疫组织化学SP法，3 mm切片用血清封闭，依次滴加一抗为兔来源的多克隆增殖细胞核抗原（PCNA）、生物素标记的羊抗兔IgG、辣根酶标记的链酶卵白素液等，PBS替代一抗作阴性对照。DAB染色后于光镜下用彩色病理图像分析系统分析其阳性表达情况，于高倍镜下（400倍）每张切片连续取10个肾小球分析肾小球阳性区域的灰度值并计算阳性细胞数。
5.统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（-±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验（Newmankeuls法），P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.生化指标 DN组大鼠血糖、24小时UAER、血胆固醇、内生肌酐清除率、尿素氮水平均较对照组明显升高（P均<0.01）。而预防组和治疗组的以上指标均较DN组降低（P<0.05或0.01），其中预防组的UAER降低较治疗组更为明显（P<0.05）。
2.光镜下肾脏病理改变 糖尿病肾病大鼠肾组织表现为以系膜细胞为主的肾固有细胞中、重度增生，系膜区基质增生，系膜区扩大，基底膜增厚，肾小球体积明显增大等改变。预防组和治疗组的上述病理改变较DN组减轻。
3.肾小球中PCNA的表达 PCNA主要表达于肾小球固有细胞的细胞核。在DN组肾小球中PCNA的表达水平（0.45±0.02）均较预防组（0.23±003）、治疗组（0.36±0.02）、对照组（0.15±0.02）明显上调（P<0.05）。而预防组、治疗组大鼠肾组织中PCNA的表达水平较DN组下调（P<0.05），其中预防组大鼠肾组织中PCNA的表达水平又较治疗组下调（P<0.05）。
讨 论
DN是糖尿病严重的微血管并发症之一，是引起我国慢性肾功能衰竭常见的病因，病情复杂、预后不良，是临床治疗上较为棘手的疾病。因此，寻找有效的药物用于糖尿病肾病的早期治疗非常重要。阿托伐他汀为HMGCoA还原酶选择性抑制剂，可显著改善内皮功能，改善肾功能，其作用是通过非降脂依赖性机制，而且效果与剂量相关[1]。几项临床研究证实阿托伐他汀可在糖尿病肾病患者中发挥治疗作用[2～4]，但其作用机制尚不明确。增殖细胞核抗原（PCNA）是调节细胞增殖的关键因子，其在静止期细胞中表达很少，在G晚期开始增高，通常在S期达高峰，到M期则开始明显下降，其作为DNA聚合酶6的辅因子，参与调节DNA合成，与细胞增殖密切相关，是评价细胞增殖活性的可靠指标。刘静等人[5]在糖尿病肾病大鼠肾组织中检测PCNA的表达，发现PCNA显著高于对照组，因此认为其在糖尿病肾病的发生、进展中起着重要作用。我们前期已经证实，调节细胞增殖的关键因子——细胞周期素和周期素依赖性激酶参与了糖尿病肾病中肾固有细胞的增殖，说明细胞增殖在糖尿病肾病的发生、进展中起着重要作用[6]。
本文通过对大鼠腹腔注射STZ成功制备了糖尿病模型，分别在糖尿病早期未出现肾脏病变时和合并肾病后给予阿托伐他汀治疗，观察阿托伐他汀预防用药和治疗用药后相关生化指标、肾脏病理改变及肾小球中PCNA的表达变化，以探讨阿托伐他汀对DN的预防和保护作用及其通过影响细胞增殖发挥的非依赖降脂作用机制。第8周大鼠肾组织符合DN病理表现，血糖、胆固醇明显升高，出现蛋白尿，肾功能出现损害，肾小球中细胞增殖的同时PCNA的表达明显上调。给予阿托伐他汀治疗后肾脏病变减轻，血糖、胆固醇下降，蛋白尿、肾功能损害减轻，肾小球中PCNA的表达减少，且早期预防用药对减少蛋白尿和下调肾小球中PCNA表达的作用较治疗用药更为显著。由此说明阿托伐他汀对DN具有保护作用，其作用机制部分是通过下调肾小球PCNA表达，抑制细胞肾小球细胞增殖而实现的，早期用药效果更佳。
综上所述，阿托伐他汀通过下调肾小球PCNA表达，抑制细胞肾小球细胞增殖实现对DN的保护作用。但阿托伐他汀在DN治疗中可能还存在其他作用机制，如对增殖以外的细胞周期等的影响还有待于进一步研究。
参考文献
[1]Shepherd J，Kastelein JJ，Bittner V，et al.Effect of intensive lipid lowering with atorvastatin on renal function in patients with coronary heart disease： the Treating to New Targets （TNT） study[J].Clin J Am Soc Nephrol，2007，2（6）：11311139.
[2]周 利，贺禄碧.前列地尔联合阿托伐他汀治疗早期糖尿病肾病疗效观察[J].中国医药导刊，2012，14（4）：649650.
[3]吴志坚.阿托伐他汀联合替米沙坦防治早期糖尿病肾病的疗效观察[J].中国当代医药，2012，19（2）：5556.
[4]钟 诚，徐 耕，金红峰，等.阿托伐他汀对冠心病伴糖尿病患者的肾脏保护作用的临床观察[J].心脑血管病防治，2012，12（2）： 97100.
[5]刘 静，陈昕丽，窦玉娟，等.增殖细胞核抗原在实验性糖尿病肾病大鼠肾组织表达中的意义[J].华北煤碳医学院学报， 2011， 13（2）： 162163.
[6]尤燕舞，林 栩，杨发奋，等.糖尿病肾病大鼠肾组织周期素D1与周期素依赖性激酶4的表达及意义[J].右江医学，2008，36（3）： 245247.
【关键词】 阿托伐他汀；糖尿病肾病；肾小球；细胞增殖
糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的严重并发症，最终进展至慢性肾功能衰竭，也是导致糖尿病患者死亡的常见原因。因此，对DN的早期治疗以延缓慢性肾脏病的进展成为临床上需要迫切解决的关键问题。阿托伐他汀是以氟苯取代吲哚环的甲羟戊酸内酯的衍生物，是全人工合成的第2个他汀类药物，无需代谢转化就具有药理活性。近年研究发现他汀类药物的肾保护作用可能材料与方法
1.糖尿病肾病大鼠模型的建立 清洁级SD雌性大鼠40只购自广西医科大学，体重在200～250 g之间，采用随机原则分为四组：糖尿病肾病组（DN组）、预防组、治疗组和对照组，每组10只。大鼠在SPF级清洁条件下饲养。DN组、预防组和治疗组均单次左下腹腔注射50 mg/kg的链尿佐菌素（STZ），注射后连续三天采集尾静脉血测血糖浓度，若血糖>16.7 mmol/L说明糖尿病造模成功。预防组于造模成功后每天给予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；治疗组于造模成功后收集24小时尿测定尿蛋白，出现明显蛋白尿（即第4周）起每天给予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；对照组仅予注射pH=4.5的柠檬酸缓冲液。
2.标本收集 第8周用代谢笼收集大鼠24小时尿液以测定尿白蛋白排泄率（Urinary Albumin Excretion Rate，UAER），麻醉方式采用乙醚吸入，经心脏取血，离心取血清用以测定血胆固醇（CHO）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），计算内生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate，Ccr）；切下肾脏，分离包膜后用10%甲醛浸泡固定，制作石蜡块，以行常规染色、免疫组化等检测。
3.光镜下分析肾脏病理改变 肾组织蜡块行3 mm切片后行HE、PAS染色，于光镜下用彩色病理图像分析系统分析肾脏病理改变。
4.免疫组化检测 采用免疫组织化学SP法，3 mm切片用血清封闭，依次滴加一抗为兔来源的多克隆增殖细胞核抗原（PCNA）、生物素标记的羊抗兔IgG、辣根酶标记的链酶卵白素液等，PBS替代一抗作阴性对照。DAB染色后于光镜下用彩色病理图像分析系统分析其阳性表达情况，于高倍镜下（400倍）每张切片连续取10个肾小球分析肾小球阳性区域的灰度值并计算阳性细胞数。
5.统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（-±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验（Newmankeuls法），P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.生化指标 DN组大鼠血糖、24小时UAER、血胆固醇、内生肌酐清除率、尿素氮水平均较对照组明显升高（P均<0.01）。而预防组和治疗组的以上指标均较DN组降低（P<0.05或0.01），其中预防组的UAER降低较治疗组更为明显（P<0.05）。
2.光镜下肾脏病理改变 糖尿病肾病大鼠肾组织表现为以系膜细胞为主的肾固有细胞中、重度增生，系膜区基质增生，系膜区扩大，基底膜增厚，肾小球体积明显增大等改变。预防组和治疗组的上述病理改变较DN组减轻。
3.肾小球中PCNA的表达 PCNA主要表达于肾小球固有细胞的细胞核。在DN组肾小球中PCNA的表达水平（0.45±0.02）均较预防组（0.23±003）、治疗组（0.36±0.02）、对照组（0.15±0.02）明显上调（P<0.05）。而预防组、治疗组大鼠肾组织中PCNA的表达水平较DN组下调（P<0.05），其中预防组大鼠肾组织中PCNA的表达水平又较治疗组下调（P<0.05）。
讨 论
DN是糖尿病严重的微血管并发症之一，是引起我国慢性肾功能衰竭常见的病因，病情复杂、预后不良，是临床治疗上较为棘手的疾病。因此，寻找有效的药物用于糖尿病肾病的早期治疗非常重要。阿托伐他汀为HMGCoA还原酶选择性抑制剂，可显著改善内皮功能，改善肾功能，其作用是通过非降脂依赖性机制，而且效果与剂量相关[1]。几项临床研究证实阿托伐他汀可在糖尿病肾病患者中发挥治疗作用[2～4]，但其作用机制尚不明确。增殖细胞核抗原（PCNA）是调节细胞增殖的关键因子，其在静止期细胞中表达很少，在G晚期开始增高，通常在S期达高峰，到M期则开始明显下降，其作为DNA聚合酶6的辅因子，参与调节DNA合成，与细胞增殖密切相关，是评价细胞增殖活性的可靠指标。刘静等人[5]在糖尿病肾病大鼠肾组织中检测PCNA的表达，发现PCNA显著高于对照组，因此认为其在糖尿病肾病的发生、进展中起着重要作用。我们前期已经证实，调节细胞增殖的关键因子——细胞周期素和周期素依赖性激酶参与了糖尿病肾病中肾固有细胞的增殖，说明细胞增殖在糖尿病肾病的发生、进展中起着重要作用[6]。
本文通过对大鼠腹腔注射STZ成功制备了糖尿病模型，分别在糖尿病早期未出现肾脏病变时和合并肾病后给予阿托伐他汀治疗，观察阿托伐他汀预防用药和治疗用药后相关生化指标、肾脏病理改变及肾小球中PCNA的表达变化，以探讨阿托伐他汀对DN的预防和保护作用及其通过影响细胞增殖发挥的非依赖降脂作用机制。第8周大鼠肾组织符合DN病理表现，血糖、胆固醇明显升高，出现蛋白尿，肾功能出现损害，肾小球中细胞增殖的同时PCNA的表达明显上调。给予阿托伐他汀治疗后肾脏病变减轻，血糖、胆固醇下降，蛋白尿、肾功能损害减轻，肾小球中PCNA的表达减少，且早期预防用药对减少蛋白尿和下调肾小球中PCNA表达的作用较治疗用药更为显著。由此说明阿托伐他汀对DN具有保护作用，其作用机制部分是通过下调肾小球PCNA表达，抑制细胞肾小球细胞增殖而实现的，早期用药效果更佳。
综上所述，阿托伐他汀通过下调肾小球PCNA表达，抑制细胞肾小球细胞增殖实现对DN的保护作用。但阿托伐他汀在DN治疗中可能还存在其他作用机制，如对增殖以外的细胞周期等的影响还有待于进一步研究。
参考文献
[1]Shepherd J，Kastelein JJ，Bittner V，et al.Effect of intensive lipid lowering with atorvastatin on renal function in patients with coronary heart disease： the Treating to New Targets （TNT） study[J].Clin J Am Soc Nephrol，2007，2（6）：11311139.
[2]周 利，贺禄碧.前列地尔联合阿托伐他汀治疗早期糖尿病肾病疗效观察[J].中国医药导刊，2012，14（4）：649650.
[3]吴志坚.阿托伐他汀联合替米沙坦防治早期糖尿病肾病的疗效观察[J].中国当代医药，2012，19（2）：5556.
[4]钟 诚，徐 耕，金红峰，等.阿托伐他汀对冠心病伴糖尿病患者的肾脏保护作用的临床观察[J].心脑血管病防治，2012，12（2）： 97100.
[5]刘 静，陈昕丽，窦玉娟，等.增殖细胞核抗原在实验性糖尿病肾病大鼠肾组织表达中的意义[J].华北煤碳医学院学报， 2011， 13（2）： 162163.
[6]尤燕舞，林 栩，杨发奋，等.糖尿病肾病大鼠肾组织周期素D1与周期素依赖性激酶4的表达及意义[J].右江医学，2008，36（3）： 245247.