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【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子α（TNFα）基因238G>A和863C>A多态性与广西壮族原发性高血压（EH）的相关性。方法采用ELISA法检测152例广西壮族EH患者（EH组）和50例广西壮族健康者（对照组）血清TNFα、血脂、血糖（FBG）水平，用PCRSBT（PCR Sequencing Based Typing）方法检测TNFα基因238G>A和863C>A多态性，探讨血压、血脂、FBG、TNFα水平与TNFα基因238G>A和863C>A的关联性。结果EH组收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、FBG、TNFα、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、体重指数（BMI）与对照组比较差异有统计学意义（P<005或0.01 ）；与对照组比较，EH组TNFα863C>A GG基因型和等位基因频率更高（P<0.05或0.01），TNFα238G>A AA基因型和等位基因频率差异无统计学意义（P>005）。结论 广西壮族原发性高血压患者血清TNFα水平增高可能与TNFα238G>A有关联，与863C>A基因多态性无明确关联。
【关键词】原发性高血压； 肿瘤坏死因子α；基因多态性
中图分类号：R544.1文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001
原发性高血压（essential hypertension，EH）是导致脑卒中、冠心病、心功能不全、肾脏疾病等重要疾病的主要危险因素之一[1]，近年来的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趋势[2]。中国疾病预防控制中心（CDC）的横断面研究表明[3]，2010年我国成年人高血压患病率为33.5%，估计患病人数为3.3亿，每年有45万人死于高血压。EH的发病机制还在探索之中，目前认为遗传和环境因素的交互作用与EH的发生、发展及转归密切相关[4]。研究表明，肿瘤坏死因子α（TNFα）基因启动区基因多态性与TNFα的转录和分泌相关[5～9]，为了解TNFα基因多态性与EH的关联性，本文探讨TNFα238G>A及TNFα863C>A多态性与广西壮族EH的相关性。1对象与方法1.1研究对象EH组选择双亲均为壮族的原发性高血压患者152例（样本来源于广西百色地区）作为观察对象，均签署知情同意书，其中男93例，女59例，平均年龄为（55.9±13.7）岁。中国高血压防治指南（2010年修订本）诊断标准，EH为：收缩压（SBP）≥140 mmHg和/或舒张压（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血压史，正在服用降压药者，虽血压<140/90 mmHg，也可入选。排除继发性高血压、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、脑梗死、心力衰竭、泌尿系统疾病、感染性疾病、肿瘤、严重的肝肾功能不全及应用抗炎药物、免疫抑制剂，不能耐受检查者。对照组为正常血压受试者50人，男30人，女20人，平均年龄为（52.9±12.7）岁，常规检查均无高血压、糖尿病、高血脂、肾病等。入选者双亲均为壮族，对象之间无血缘关系，年龄、性别构成与EH组比较差异无统计学意义（P>005）。
1.2研究方法
1.2.1血压的测量方法受检者均于早晨6：00～7：00进行，取卧位，采用校正水银血压计，以Korotkoff法测量右上臂SBP、DBP，每次间隔5 min，连续测量3次，取平均值为血压值，并测量身高和体重。
1.2.2生化指标的检测受检者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取静脉血约7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天内提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后离心3000 r/min 20 min分装血清，一部分直接送检空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指标，一部分置于-80℃冰箱中以备检测TNFα血清水平。
1.2.3血清TNFα的测定采用酶联免疫吸附测定法（ELISA），操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。使用美国BIORAD680酶标仪450 nm波长下测量各孔OD值，用专业软件Curve Expert 1.3绘制标准曲线，r=0.99987，根据样本OD值计算出相应的浓度，即为对应样本的血清浓度。
1.2.4基因组DNA的制备采用离心柱型提取血液基因组DNA，操作方法严格按照人血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行，试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。经超微量分光光度计NanoVue检测OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分装后放置-80℃冰箱备用。
1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多态性检测PCR扩增： PCR扩增仪为BioRadPTC200，PCR试剂Premix Ex TaqTMVersion 2.0购自日本TAKARA。引物（Primer）由宝生物工程（大连）有限公司设计及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，FP）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR总反应体系为50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（浓度0.5～1.0 μg），灭菌蒸馏水20 μl，上下游引物各1 μl，样品混合后置PCR仪30个循环。TNFα238G>A反应条件：98℃变性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反应条件：98 ℃变性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A扩增片段长度为321 bp，TNFα863C>A扩增片段长度为302 bp。反应完成后取PCR产物5 μl用质量分数为2%的琼脂糖凝胶垂直电泳观察PCR产物情况，电压90 mV时间30 min，电泳液为0.5×TBE液，若相应位置有清晰扩增单一条带，则纯化后行测序反应。
1.2.6PCR产物纯化及测序使用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物条带和浓度，对PCR产物浓度进行过膜纯化或者切胶纯化以及定量，采用sanger法进行测序，测序分析仪为3730XL测序分析仪，测序胶是POP7，均购自美国AB公司。测定结果出现双峰， 则该位点为杂合子型， 出现单峰为纯合子型。使用chromatogram file 软件分析测序结果，采用直接基因计数法对基因型及等位基因频率进行统计。
【关键词】原发性高血压； 肿瘤坏死因子α；基因多态性
中图分类号：R544.1文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001
原发性高血压（essential hypertension，EH）是导致脑卒中、冠心病、心功能不全、肾脏疾病等重要疾病的主要危险因素之一[1]，近年来的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趋势[2]。中国疾病预防控制中心（CDC）的横断面研究表明[3]，2010年我国成年人高血压患病率为33.5%，估计患病人数为3.3亿，每年有45万人死于高血压。EH的发病机制还在探索之中，目前认为遗传和环境因素的交互作用与EH的发生、发展及转归密切相关[4]。研究表明，肿瘤坏死因子α（TNFα）基因启动区基因多态性与TNFα的转录和分泌相关[5～9]，为了解TNFα基因多态性与EH的关联性，本文探讨TNFα238G>A及TNFα863C>A多态性与广西壮族EH的相关性。1对象与方法1.1研究对象EH组选择双亲均为壮族的原发性高血压患者152例（样本来源于广西百色地区）作为观察对象，均签署知情同意书，其中男93例，女59例，平均年龄为（55.9±13.7）岁。中国高血压防治指南（2010年修订本）诊断标准，EH为：收缩压（SBP）≥140 mmHg和/或舒张压（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血压史，正在服用降压药者，虽血压<140/90 mmHg，也可入选。排除继发性高血压、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、脑梗死、心力衰竭、泌尿系统疾病、感染性疾病、肿瘤、严重的肝肾功能不全及应用抗炎药物、免疫抑制剂，不能耐受检查者。对照组为正常血压受试者50人，男30人，女20人，平均年龄为（52.9±12.7）岁，常规检查均无高血压、糖尿病、高血脂、肾病等。入选者双亲均为壮族，对象之间无血缘关系，年龄、性别构成与EH组比较差异无统计学意义（P>005）。
1.2研究方法
1.2.1血压的测量方法受检者均于早晨6：00～7：00进行，取卧位，采用校正水银血压计，以Korotkoff法测量右上臂SBP、DBP，每次间隔5 min，连续测量3次，取平均值为血压值，并测量身高和体重。
1.2.2生化指标的检测受检者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取静脉血约7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天内提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后离心3000 r/min 20 min分装血清，一部分直接送检空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指标，一部分置于-80℃冰箱中以备检测TNFα血清水平。
1.2.3血清TNFα的测定采用酶联免疫吸附测定法（ELISA），操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。使用美国BIORAD680酶标仪450 nm波长下测量各孔OD值，用专业软件Curve Expert 1.3绘制标准曲线，r=0.99987，根据样本OD值计算出相应的浓度，即为对应样本的血清浓度。
1.2.4基因组DNA的制备采用离心柱型提取血液基因组DNA，操作方法严格按照人血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行，试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。经超微量分光光度计NanoVue检测OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分装后放置-80℃冰箱备用。
1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多态性检测PCR扩增： PCR扩增仪为BioRadPTC200，PCR试剂Premix Ex TaqTMVersion 2.0购自日本TAKARA。引物（Primer）由宝生物工程（大连）有限公司设计及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，FP）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR总反应体系为50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（浓度0.5～1.0 μg），灭菌蒸馏水20 μl，上下游引物各1 μl，样品混合后置PCR仪30个循环。TNFα238G>A反应条件：98℃变性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反应条件：98 ℃变性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A扩增片段长度为321 bp，TNFα863C>A扩增片段长度为302 bp。反应完成后取PCR产物5 μl用质量分数为2%的琼脂糖凝胶垂直电泳观察PCR产物情况，电压90 mV时间30 min，电泳液为0.5×TBE液，若相应位置有清晰扩增单一条带，则纯化后行测序反应。
1.2.6PCR产物纯化及测序使用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物条带和浓度，对PCR产物浓度进行过膜纯化或者切胶纯化以及定量，采用sanger法进行测序，测序分析仪为3730XL测序分析仪，测序胶是POP7，均购自美国AB公司。测定结果出现双峰， 则该位点为杂合子型， 出现单峰为纯合子型。使用chromatogram file 软件分析测序结果，采用直接基因计数法对基因型及等位基因频率进行统计。