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背景:“毒损脑络”是急性脑血管病的主要病机,以脑微血管损伤为主要表现。目的:建立不同缺氧缺血再灌注时间的细胞模型及施加药物干预,观察清开灵注射液对不同损伤程度人脐静脉内皮细胞ECV304的保护作用。设计:以培养的细胞为观察对象的随机对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科。材料:实验于2002-02/04在北京中医药大学附属东直门医院中心实验室完成。实验用人脐静脉内皮细胞ECV304随机分为7组,即正常组、缺氧6h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组、缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组。清开灵注射液主要成分为牛胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子总苷等。方法:缺血再灌注模型的制作:①从培养箱中取出培养的细胞,缺氧6h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h对照组分别吸除原培养液,换入无糖Earle’s液,细胞放入缺氧槽中37℃缺血缺氧培养。缺氧6h再灌注12h对照组培养6h,缺氧24h再灌注12h对照组培养24h后,分别吸去无糖Earle’s液,换入无血清1640液后置于37℃CO2培养箱中再灌注培养12h。②缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组分别在缺氧24h再灌注12h对照组造模的基础上,向各自培养液中加入质量浓度为5,10,20mg/L的清开灵对细胞进行培养。③缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组在缺氧6h再灌注12h对照组造模的基础上,向培养液中加入质量浓度为10mg/L的清开灵。④细胞存活率以四唑盐比色试验测定,乳酸脱氢酶漏出率用乳酸脱氢酶试剂盒测定,细胞凋亡率行碘化吡啶染色后用流式细胞仪检测,Cellquest软件进行分析。主要观察指标:①细胞形态学观察结果。②各组细胞存活率、乳酸脱氢酶漏出率及细胞凋亡率。结果:①细胞形态学观察:正常组细胞密集,贴壁良好,伸展充分,细胞表面光滑,有较多的分裂期细胞,细胞长满底面,呈典型的“铺路石征”;缺氧6h再灌注12h对照组及缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组细胞形态改变不明显;缺氧24h再灌注12h对照组细胞较稀疏,脱壁较多,可见大量肿胀变圆的损伤细胞及破碎细胞的碎片,贴壁细胞皱缩明显,可见伪足,分裂期细胞少;缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组细胞贴壁良好,表面光滑,未发生皱缩,可见分裂期细胞。②各组ECV304细胞存活率:与缺氧24h再灌注12h对照组比较,缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高犤(42.5±2.8),(72.9±8.0),(80.3±12.7)%,P均<0.01犦,而缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组则显著下降至(10.1±0.4)%,P<0.01。正常组为100%。③各组ECV304细胞乳酸脱氢酶漏出率:与缺氧24h再灌注12h对照组比较,缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高犤(6.6±1.4),(2.4±1.4),(2.4±0.5)%,P均<0.01犦,而缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组则显著升高至(16.1±2.2)%,P<0.01。正常组为(2.2±1.0)%。④各组ECV304细胞凋亡率:与缺氧6h再灌注12h对照组比较,缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组明显升高犤(2.2±0.5),(1.5±0.4)%,P<0.05犦;与正常组比较,缺氧24h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高犤(0.9±0.2),(5.5±2.5),(9.9±4.3)%,P均<0.01犦;并且缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组比与缺氧24h再灌注12h对照组升高更明显(P<0.01)。结论:①清开灵注射液对不同程度缺血再灌注损伤的ECV304细胞均有保护作用,但随着损伤程度的不同而表现为两种相反的保护形式。②对于缺血6h再灌注12h此类受损伤较轻的ECV304细胞,主要表现为降低细胞的凋亡率;而对于缺血24h再灌注12h此类缺血再灌注损伤较重的ECV304细胞,则增加细胞的凋亡率,使坏死的细胞减少。③与坏死细胞相比,凋亡细胞不发生溶酶体、线粒体及胞膜的破裂,没有内涵物的外泄,故不引起周围细胞的次级损伤,从而提高了细胞存活率,起到保护大多数细胞的作用。