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摘要：目的：探讨miR-765对线粒体自噬发生的调控关系，以及对多发性骨髓瘤的发生发展的影响。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（RFQ-PCR）及蛋白质印迹western bot试验技术测定靶基因及靶自噬关键蛋白的准确含量。结果：多发性骨髓瘤患者化疗前miR-765及自噬关键蛋白表达水平变化均显著高于正常对照（P<0.05），miR-765和自噬关键蛋白表达水平变化具有正相关性。结论：miR-765可以调控线粒体自噬的发生，而通过调控线粒体自噬的发生进一步影响多发性骨髓瘤的发生和发展。
关键词：线粒体自噬;多发性骨髓瘤;蛋白质印迹试验western bot
【中图分类号】R730.4 【文獻标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）12--02
引言
多发性骨髓瘤是一种以骨髓浆细胞恶性克隆性增殖为特征的B淋巴细胞恶性肿瘤，与骨髓基质细胞密切相关 [1]- [2]。其自分泌或旁分泌可溶性细胞，这些细胞分泌细胞因子调控线粒体自噬的发生促进多发性骨髓瘤的发生发展 [3]- [4]。细胞因子中即包括miR-765蛋白，其为TNF家族新成员，因具有促进肿瘤细胞增殖作用而命名，为幼稚、原始及活化B淋巴细胞的主要调控线粒体自噬的发生促进多发性骨髓瘤的发生发展因子之一。
Western Blot它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种蛋白质印迹法实验方法。现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
在多发性骨髓瘤细胞受外源性调控线粒体自噬激活的各种信号途径中，NF-кB 途径可能是最主要的途径之一。目前研究已证实，能直接激活NF-кB途径的miR-765，已经被确认是多发性骨髓瘤细胞的主要存活调控线粒体自噬的发展发生促进多发性骨髓瘤的发生因子及生长调控线粒体自噬的发展发生促进多发性骨髓瘤的发生因子，骨髓瘤细胞系及幼稚骨髓瘤细胞高表达miR-765。miR-765被发现具有保护多发性骨髓瘤、B-CLL细胞避免自发性凋亡及药物诱导性凋亡作用，同时可提高其细胞存活能力。故目前认为，对miR-765的研究极有可能成为肿瘤，尤其是B淋巴细胞恶性肿瘤研究的新方向。
本研究采用RFQ-PCR及western bot试验技术，测定不同分期多发性骨髓瘤首次就诊及应用一周期VAD方案化疗后患者外周血血浆中自噬关键蛋白及单个核细胞中miR-765的表达发展情况，并归纳总结miR-765表达发展与多发性骨髓瘤不同分期及化疗前后间的关系，以期在多发性骨髓瘤早期诊断、早期治疗、预测疾病活动以及寻找预后生物参数等方面发挥重要作用，并为临床治疗新方法提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
62份标本均取自井冈山大学附属医院血液科2020年4月～2021年5月住院的31例初诊及一周期VAD方案化疗后患者外周血。其中男22例， 女9例，中位年龄65岁（46～82岁）。多发性骨髓瘤 Ⅰ期6例，Ⅱ期9期，Ⅲ期16例，其中A组12例，B组19例。15份健康供者标本，中位年龄69岁（55～80岁）。多发性骨髓瘤分型、疗效标准及疾病诊断采用《血液病诊断及疗效标准》，由张之南主编。多发性骨髓瘤分期按国际分期系统（ISS）进行。
1.2 western bot（蛋白质印迹法）材料
限制性内切酶、T4 DNA连接酶; pGEM-T载体试剂盒;Trizol 试剂;X-gal、Taq DNA聚合酶;逆转录试剂盒（Qiagen公司）;DL-2000;胶回收试剂盒;ELISA试剂盒、自噬关键蛋白紫外分析仪、荧光定量PCR仪、全自动酶标仪。
1.3 western bot试验（蛋白质印迹法）
1.3.1制备标本
取化疗前及后患者外周血6 mL，应用EDTA抗凝， 2 mL提取血浆，4 mL分离出单个核细胞。
1.3.2设计探针及引物
据注册号为NM012512的自噬关键蛋白（Pink1，parkin NIX） 全序列（内参）和miR-765 （注册号为AF04688 ），设计相应引物和荧光探针并合成。
1.3.3 构建调控线粒体自噬基因（miR-765）及内参β-ACTIN及自噬关键蛋白（Pink1，parkin NIX）标准品
细胞总RNA经Trizol法提取后检测其浓度和纯度，并进行逆转录反应， cDNA进行扩增目的片段，胶回收电泳PCR产物与T载体连接，连接产物经过蓝白斑western bot试验筛选出重组质粒，提取出小量，阳性克隆经EcoRⅠ酶切western bot试验鉴定、测序分析证实后进一步扩增，质粒抽提，再经自噬关键蛋白紫外分析仪定量，按倍比稀释后保存。
1.3.4 RFQ-PCR检测miR-765含量
在离心管中加入反应体系，并设5个miR-765标准品、空白管及阴性管各3个复孔作为对照。PCR 扩增在荧光定量检测仪中进行。由电脑软件计算出标本中miR-765值， 将miR-765与Pink1，parkin NIX比值定为评估miR-765表达水平变化的标值。
1.3.5 western bot方法检测自噬关键蛋白含量