论文部分内容阅读
摘要 [目的]评价人血清白蛋白纳米颗粒载体以及林源活性成分纳米颗粒制剂的安全性。[方法]以人血清白蛋白制备纳米颗粒载体，包埋红豆杉属植物抗癌活性成分紫杉醇及其衍生物多西紫杉醇，开展细胞实验和动物实验。[结果]与紫杉醇和多西紫杉醇市售制剂的溶剂相比，纳米颗粒载体对MCF-7细胞和C57BL/6 小鼠的毒性比较小；紫杉醇和多西紫杉醇的纳米颗粒制剂对BALB/C-nu/nu裸鼠的最大耐受剂量大于市售制剂Taxol和Taxotere （40、30 mg/kg）。[结论]紫杉醇和多西紫杉醇的纳米颗粒制剂有很大的市场前景，而蛋白纳米载体技术在林源活性成分的应用研究中具有重要的推广价值。
关键词 林源活性成分；纳米载体；人血清白蛋白；安全性评价
中图分类号 S789 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2018）32-0102-04
Safety Evaluation on the Nanocarrier of the Active Ingredients from Forest
YANG Shaozong，LIU Bentong，QIAN Hua et al （Institute of Forest Food，Zhejiang Academy of Forestry，Hangzhou，Zhejiang 310023）
Abstract [Objective] To evaluate the safety of the human serum albumin nanoparticle carrier and active ingredientsloaded nanoparticle formulation.[Method] A human serum albumin nanoparticle was designed to deliver paclitaxel and docetaxel，the anticancer ingredients derived from the bark of the Pacific yew or Western yew tree （Taxus Linn.）.In vitro experiments in human breast cancer MCF7 cells and in vivo experiments in C57BL/6 mice and BALB/Cnu/nu nude mice were performed.[Result]The toxicity of human serum albumin nanoparticle carrier to the MCF7 cells and C57BL/6 mice was much less than that of the solvents in the Taxol and Taxotere .The maximum tolerated dose of paclitaxel/docetaxelloaded nanoparticle formulations was higher than that of Taxol and Taxotere （40，30 mg/kg） in BALB/Cnu/nu nude mice.[Conclusion] The paclitaxel/docetaxelloaded nanoparticle formulation will possess good market prospect.The proteinbased nanocarrier has important value for extension and application of active ingredients from forest.
Key words Active ingredients from forest；Nanocarrier；Human serum albumin；Safety evaluation
基金项目 浙江省自然科学基金项目（LQ15C160001）；中央财政林业科技推广示范资金项目（〔2017〕TS01）。
作者简介 杨少宗（1974—），男，安徽阜阳人，副研究员，博士，从事林源中药活性成分开发研究。*通讯作者，副教授，博士，从事蛋白纳米技术应用研究。
收稿日期 2018-09-18
林源活性成分是指存在于木本植物體内的除水分、糖、蛋白质、脂肪以外的次生代谢产物，例如萜类、黄酮、生物碱、甾体、木质素、矿物质等。林源活性成分来源广泛，具多种功能，被广泛应用于功能性食品及药品的开发。然而，在具体应用时存在不稳定、水溶性差等问题，导致其生物利用度低。如何高效利用林源活性成分不仅是食品和医药科学领域亟待解决的问题，而且是林业科技发展不可或缺的研究内容[1-2]。
在提高活性物质功效的研究中，载体的应用十分广泛。纳米载体是一种纳米级微观范畴（<100 nm）的亚微粒输送系统，具有纳米尺寸效应及较高的比表面积，展现了诸多优点：增加包埋成分水溶性、克服生物学屏障、具靶向性、控制药物释放[3-5]。然而，各种研究表明，载体在提高被包埋成分的活性作用的同时，也带来了新的安全隐患。因此，理想的药物载体除了功能性还应具有良好的安全性[6-7]。
该研究以人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）作为纳米载体的制备材料，包埋红豆杉[Taxus chinensis （Pilger） Rehd.]的抗癌活性成分紫杉醇（paclitaxel，PTX）及其衍生物多西紫杉醇（docetaxel，DOC），以市售的紫杉醇制剂Taxol和多西紫杉醇制剂Taxotere为参照，利用人乳腺癌细胞MCF-7、C57BL/6 小鼠和BALB/C-nu/nu裸鼠展开实验，通过细胞存活率（cell survival rate，CSR）、给药前后体重变化以及最大耐受剂量（the maximum tolerated dose，MTD）等指标对人血清白蛋白纳米载体的安全性及紫杉醇（多西紫杉醇）纳米颗粒制剂的毒理进行评价。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫杉醇和多西紫杉醇购自南京泽朗医药科技有限公司；人血清白蛋白（第5组分，A-1653）和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，色谱纯）购自美国Sigma公司；Taxol购自意大利Bristol-Myers Squibb 公司；Taxotere购自法国Sanofi公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Penicillin-Streptomycin购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。其他药品均为国产色谱纯或分析纯，实验用水均为超纯水。
1.2 细胞株和实验动物 人乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。C57BL/6 小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄；BALB/C-nu/nu裸鼠，SPF级，雄性，6～8周龄，实验动物购自上海BK公司。
1.3 方法
1.3.1 纳米颗粒的制备。
1.3.1.1 人血清白蛋白纳米颗粒（HSANP）。将人血清白蛋白储存液稀释后加入30% （V/V） DMSO溶液，搅拌混匀5 min（500 r/min），静置可得人血清白蛋白纳米颗粒溶液，冷冻干燥机处理48 h后去除溶液中的水和DMSO，得到人血清白蛋白纳米颗粒冻干粉末。
1.3.1.2 包埋紫杉醇/多西紫杉醇的纳米颗粒。将人血清白蛋白储存液稀释后加入适量以DMSO为溶剂的紫杉醇/多西紫杉醇溶液，最终体系中人血清白蛋白和紫杉醇/多西紫杉醇的摩尔比为1∶10，DMSO的量维持在30% （V/V），搅拌混匀5 min（500 r/min），静置可得包埋紫杉醇/多西紫杉醇纳米颗粒溶液，冷冻干燥机处理48 h后去除溶液中的水和DMSO，可得冻干粉末，复溶后离心30 min（10 000 r/min），取上清液再次冷冻干燥即可得包埋紫杉醇纳米颗粒粉末（HSANP-PTX）和包埋多西紫杉醇纳米颗粒粉末（HSANP-DOC）。
1.3.2 细胞培养和药物作用。将
细胞置于10% 胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞。所有实验药物以生理盐水为溶剂，配成储备液，在使用前，直接用培养基稀释到设定浓度，以生理盐水为空白对照组。
1.3.3 细胞毒性实验。
细胞毒性实验采用CCK-8法[8-9]：取对数生长期细胞，用0.025%胰蛋白酶消化后重悬、DMEM培养基稀释至100个/μL；将细胞种于96孔培养板中，每孔50 μL，加入DMEM稀释的药物50 μL，在未计入培养基的孔中补加100 μL 缓冲液；将培养板放入CO2培养箱中培养48 h，取出后每孔加入CCK-8溶液10 μL孵育1 h；在450 nm波长下检测OD值，通过公式（1）计算CSR。
CSR=ODtest-ODblankODcontrol-ODblank×100%（1）
1.3.4 荷瘤裸鼠模型的建立。
将对数期的MCF-7细胞制备成1.0×107个/mL的单细胞悬液，取6～8周龄裸鼠，于左前肢腋下皮下注射细胞悬液0.2 mL，建立皮下移植瘤裸鼠模型，建模后继续在人工光照环境下喂养，肿瘤体积达200 mm3时待用。
1.3.5 C57BL/6小鼠给药方案。
将C57BL/6小鼠分为9组，每组10只。采取尾静脉注射给药，给药体积10 mL/kg，连续给药10 d，每次剂量相同。给药后观察小鼠30 min，记录小鼠进食、饮水、体温等情况，并分别于第1次给药前1 d和停药后第2天称取小鼠体重。
1.3.6 荷瘤裸鼠给药方案。将BALB/C-nu/nu裸鼠分为16组，每组6只。采取尾静脉注射给药，给药体积10 mL/kg，于接种后第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天给药，每次剂量相同。给药后观察裸鼠30 min，记录小鼠进食、饮水、体温等情况，并分别于第1次给药前1 d和停药后第2天称取小鼠体重。
1.4 数据统计 数据以均值±标准差表示，统计学比较采用双侧T检验，P<0.05表示差异有显著性统计学意义。
2 结果与分析
2.1 人血清白蛋白纳米颗粒载体的安全性评价
2.1.1 人血清白蛋白纳米颗粒载体的细胞毒理分析。
以人乳腺癌MCF-7细胞为模型，以市售制剂Taxol的溶剂CrEL[聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇（50∶50，V/V）]和Taxotere的溶剂T80[吐温-80和13%乙醇（25∶75，V/V）]为参照，对人血清白蛋白纳米颗粒载体的细胞毒性进行研究。由表1可知，在HSANP的所有处理组中，CSR均>90%，表明MCF-7细胞生长不受HSANP的影响。然而，在CrEL和T80中，MCF-7细胞生长明显受阻，且随着处理浓度的增大，CSR显著下降。该结果表明，人血清白蛋白纳米颗粒作为林源活性成分的载体，与助溶溶剂相比，其细胞毒性非常小。
2.1.2 人血清白蛋白纳米颗粒载体对C57BL/6小鼠生长的影響。HSANP 3个剂量组的小鼠给药后无异常，实验期间饮食、行为无明显改变，无死亡现象发生。而CrEL和T80的实验组中，中剂量给药后出现静卧、冷漠，30 min后基本恢复，高剂量组给药后出现昏厥，CrEL组有4只小鼠死亡，T80组有3只小鼠死亡，剩余小鼠30 min后逐渐恢复。所有小鼠给药前后体重的变化如表2所示，在人血清白蛋白纳米颗粒载体3个实验组中，小鼠体重在给药前后均未发生显著性变化，而在2种溶剂的不同剂量实验组中，小鼠体重在给药前后均发生了显著性变化，且随着剂量的增加，体重减轻现象愈加明显。由此可知，与助溶溶剂相比，人血清白蛋白纳米颗粒载体对小鼠的生长影响较小。 2.2 紫杉醇（多西紫杉醇）納米颗粒的安全性评价
荷瘤裸鼠对Taxol、Taxotere、HSANP-PTX和HSANP-DOC的MTD结果见表3，Taxol实验组中荷瘤裸鼠在30 mg/kg时给药后就表现出静卧、冷漠，在40 mg/kg时给药后昏厥，并有部分裸鼠（4/6）死亡，在50 mg/kg时所有裸鼠给药后立即死亡；Taxotere实验组中荷瘤裸鼠在30 mg/kg时给药后表现出静卧、冷漠，在40 mg/kg时给药后昏厥，并有部分裸鼠（3/6）死亡，在50 mg/kg时所有裸鼠给药后立即死亡；HSANP-PTX在30、40 mg/kg时给药后均表现正常，在50 mg/kg时，给药后出现静卧、冷漠，30 min后精神状态基本恢复；在60 mg/kg时出现昏厥，部分裸鼠（3/6）死亡。HSANP-DOC在30、40 mg/kg时给药后均表现正常，在50 mg/kg 时，给药后出现静卧、冷漠，30 min后精神状态基本恢复，其中有1只裸鼠给药后昏厥，30 min 后未恢复，发生死亡；在60 mg/kg时出现昏厥，部分裸鼠（4/6）死亡。
所有组别在给药前后体重的变化见图1。在市售制剂Taxol和Taxotere实验组中，2个较低剂量（20、30 mg/kg）裸鼠的体重在给药前后变化不显著，这与实验的实施方案有关，荷瘤裸鼠的给药是在裸鼠瘤体长至（200±20）mm3时进行，裸鼠称量的体重均为裸鼠本身体重加上瘤体重量。在较低剂量时，虽然药物Taxol和Taxotere对裸鼠生长有影响，但瘤体的增长导致最终体重未减轻或有所增加。在剂量增加至40、50 mg/kg时，体重减轻很明显（减轻量>10%）。在HSANP-PTX和HSANP-DOC实验组中，裸鼠体重也随剂量的增加而减少，但与Taxol和Taxotere相比，剂量的影响程
度要小，当剂量为30、40 mg/kg时，HSANP-PTX和HSANP-DOC实验组裸鼠的体重无显著性变化，当剂量增至50、60 mg/kg时，裸鼠体重明显减轻（>10%）。MTD定义为观察期内不引起动物死亡且动物体重减少不超过10%的最大剂量[10-11]。综上所述，对于裸鼠来说，市售制剂Taxol和Taxotere的MTD为30 mg/kg，这与文献报道的Taxol和Taxotere在小鼠上的MTD为20～40 mg/kg是符合的[12-14]，而HSANP-PTX和HSANP-DOC为40 mg/kg。
3 结论与讨论
为评价人血清白蛋白纳米颗粒作为载体应用于林源活性成分的安全性，展开了细胞实验和动物实验，并以市售制剂Taxol和Taxotere
为参照，研究了人血清白蛋白纳米颗粒载体对细胞生长和动物生存的影响。数据表明，与市售制剂中的溶剂相比，人血清白蛋白纳米颗粒载体不论是对MCF-7细胞还是对C57BL/6小鼠毒性作用都很小。林源活性成分紫杉醇和多西紫杉醇占据抗肿瘤药物市场植物提取物单品排名的前2位，具广谱抗肿瘤性，然而研究证明他们对正常人体组织也有毒性。因此，Taxol和Taxotere使用后对人体的伤害一部分是溶剂造成的，例如CrEL导致的超敏反应，而另一部分伤害与紫杉醇（多西紫杉醇）本身毒性有关。之前的研究表明，人血清白蛋白纳米颗粒载体对包埋的活性成分（紫杉醇和多西紫杉醇）有很好的缓释作用，从而可以降低紫杉醇/多西紫杉醇对机体组织的毒性[15-18]。由荷瘤裸鼠的最大耐受剂量实验数据表明，与Taxol和Taxotere相比，HSANP-PTX和HSANP-DOC的毒性要小，前者的MTD为30 mg/kg，后者为40 mg/kg，证明被纳米颗粒载体包埋后的紫杉醇/多西紫杉醇的毒性得到了缓解。
综上所述，对于林源活性成分紫杉醇和多西紫杉醇来说，与溶剂型制剂相比，由人血清白蛋白纳米颗粒载体包埋的制剂安全性更高。同时结合之前对于HSANP-PTX和HSANP-DOC抗癌活性的研究结果[18]，可得出结论：与溶剂型制剂相比，紫杉醇和多西紫杉醇的纳米颗粒制剂更具优势，具有很大的市场前景，也证明蛋白纳米载体在林源活性成分的应用研究中具有重要的推广价值。
参考文献
[1]
国家林业局.“十一五”国家科技支撑计划项目“商品林定向培育及高效利用关键技术研究”课题申请指南[Z].北京：国家林业局，2006.
[2] 国家林业局.2013年度引进国际先进林业科学技术项目申报指南[Z].北京：国家林业局，2013.
[3] WILSON B，SAMANTA M K，SANTHI K，et al.Chitosan nanoparticles as a new delivery system for the antiAlzheimer drug tacrine[J].Nanomedicine：Nanotechnology，biology and medicine，2010，6（1）：144-152.
[4] PODARALLA S，AVERINENI R，ALQAHTANI M，et al.Synthesis of novel biodegradable methoxy poly（ethylene glycol）zein micelles for effective delivery of curcumin[J].Molecular pharmaceutics，2012，9（9）：2778-2786.
[5] ZHANG Z H，WANG X P，AYMAN W Y，et al.Studies onlactoferrin nanoparticles of gambogic acid for oral delivery[J].Drug delivery，2013，20（2）：86-93. [6] INOUE K，TAKANO H，YANAGISAWA R，et al.Size effects of latex nanomaterials on lung inflammation in mice[J].Toxicology and applied pharmacology，2009，234（1）：68-76.
[7] FANG R，YANG S Z，WANG Y B，et al.Nanoscale drug delivery systems：A current review on the promising paclitaxel formulations for future cancer therapy[J].Nano brief reports and reviews，2015，10（5）：150310190305009.
[8] CHANG Y L，YANG S T，LIU J H，et al.In vitro toxicity evaluation of graphene oxide on A549 cells [J].Toxicology letters，2011，200（3）：201-210.
[9] CHEN J，LIN C R，YONG W，et al.Calycosin and genistein induce apoptosis by inactivation of HOTAIR/pAkt signaling pathway in human breast cancer MCF7 cells [J].Cellular physiology and biochemistry，2015，35（2）：722-728.
[10] YANG D B，LIU X Q，JIANG X G，et al.Effect of molecular weight of PGGpaclitaxel conjugates on in vitro and in vivo efficacy[J].Journal of controlled release，2012，161（1）：124-131.
[11] 李敏.紫杉醇-Pluronic P123復合型胶束给药系统的研究[D].济南：山东大学，2013.
[12] LE GARREC D，GORI S，LUO L，et al.Poly （Nvinylpyrrolidone）blockpoly （D，Llactide） as a new polymeric solubilizer for hydrophobic anticancer drugs：In vitro and in vivo evaluation[J].Journal of controlled release，2004，99（1）：83-101.
[13] WANG C，WANG Y J，WANG Y J，et al.Characterization，pharmacokinetics and disposition of novel nanoscale preparations of paclitaxel[J].International journal of pharmaceutics，2011，414（1/2）：251-259.
[14] KWON G S.Polymeric micelles for multipledrug delivery[M]//SVENSON S，PRUD′HOMME R K.Multifunctional nanoparticles for drug delivery applications：Imaging，targeting，and delivery.Boston，MA：Springer，2012：133-152.
[15] HOUGHTON P J，KURMASHEVA R T，KOLB E A，et al.Initial testing （stage 1） of the tubulin binding agent nanoparticle albuminbound （nab） paclitaxel （Abraxane） by the Pediatric Preclinical Testing Program （PPTP）[J].Pediatric blood & cancer，2015，62（7）：1214-1221.
[16] MOCAN L，MATEA C，TABARAN F A，et al.Photothermal treatment of liver cancer with albuminconjugated gold nanoparticles initiates Golgi ApparatusER dysfunction and caspase3 apoptotic pathway activation by selective targeting of Gp60 receptor[J].International journal of nanomedicine，2015，10：5435-5445.
[17] ZHAO M Z，LEI C N，YANG Y D，et al.Abraxane，the nanoparticle formulation of paclitaxel can induce drug resistance by upregulation of Pgp[J].PLoS One，2015，10（7）：1-19.
[18] FANG R，LIU B T，YANG S Z，et al.Design and biological evaluation of longterm sustained release taxanes loaded human serum albumin nanoparticles[J].Nanoscience and nanotechnology letters，2018，10：1-9.
关键词 林源活性成分；纳米载体；人血清白蛋白；安全性评价
中图分类号 S789 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2018）32-0102-04
Safety Evaluation on the Nanocarrier of the Active Ingredients from Forest
YANG Shaozong，LIU Bentong，QIAN Hua et al （Institute of Forest Food，Zhejiang Academy of Forestry，Hangzhou，Zhejiang 310023）
Abstract [Objective] To evaluate the safety of the human serum albumin nanoparticle carrier and active ingredientsloaded nanoparticle formulation.[Method] A human serum albumin nanoparticle was designed to deliver paclitaxel and docetaxel，the anticancer ingredients derived from the bark of the Pacific yew or Western yew tree （Taxus Linn.）.In vitro experiments in human breast cancer MCF7 cells and in vivo experiments in C57BL/6 mice and BALB/Cnu/nu nude mice were performed.[Result]The toxicity of human serum albumin nanoparticle carrier to the MCF7 cells and C57BL/6 mice was much less than that of the solvents in the Taxol and Taxotere .The maximum tolerated dose of paclitaxel/docetaxelloaded nanoparticle formulations was higher than that of Taxol and Taxotere （40，30 mg/kg） in BALB/Cnu/nu nude mice.[Conclusion] The paclitaxel/docetaxelloaded nanoparticle formulation will possess good market prospect.The proteinbased nanocarrier has important value for extension and application of active ingredients from forest.
Key words Active ingredients from forest；Nanocarrier；Human serum albumin；Safety evaluation
基金项目 浙江省自然科学基金项目（LQ15C160001）；中央财政林业科技推广示范资金项目（〔2017〕TS01）。
作者简介 杨少宗（1974—），男，安徽阜阳人，副研究员，博士，从事林源中药活性成分开发研究。*通讯作者，副教授，博士，从事蛋白纳米技术应用研究。
收稿日期 2018-09-18
林源活性成分是指存在于木本植物體内的除水分、糖、蛋白质、脂肪以外的次生代谢产物，例如萜类、黄酮、生物碱、甾体、木质素、矿物质等。林源活性成分来源广泛，具多种功能，被广泛应用于功能性食品及药品的开发。然而，在具体应用时存在不稳定、水溶性差等问题，导致其生物利用度低。如何高效利用林源活性成分不仅是食品和医药科学领域亟待解决的问题，而且是林业科技发展不可或缺的研究内容[1-2]。
在提高活性物质功效的研究中，载体的应用十分广泛。纳米载体是一种纳米级微观范畴（<100 nm）的亚微粒输送系统，具有纳米尺寸效应及较高的比表面积，展现了诸多优点：增加包埋成分水溶性、克服生物学屏障、具靶向性、控制药物释放[3-5]。然而，各种研究表明，载体在提高被包埋成分的活性作用的同时，也带来了新的安全隐患。因此，理想的药物载体除了功能性还应具有良好的安全性[6-7]。
该研究以人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）作为纳米载体的制备材料，包埋红豆杉[Taxus chinensis （Pilger） Rehd.]的抗癌活性成分紫杉醇（paclitaxel，PTX）及其衍生物多西紫杉醇（docetaxel，DOC），以市售的紫杉醇制剂Taxol和多西紫杉醇制剂Taxotere为参照，利用人乳腺癌细胞MCF-7、C57BL/6 小鼠和BALB/C-nu/nu裸鼠展开实验，通过细胞存活率（cell survival rate，CSR）、给药前后体重变化以及最大耐受剂量（the maximum tolerated dose，MTD）等指标对人血清白蛋白纳米载体的安全性及紫杉醇（多西紫杉醇）纳米颗粒制剂的毒理进行评价。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫杉醇和多西紫杉醇购自南京泽朗医药科技有限公司；人血清白蛋白（第5组分，A-1653）和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，色谱纯）购自美国Sigma公司；Taxol购自意大利Bristol-Myers Squibb 公司；Taxotere购自法国Sanofi公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Penicillin-Streptomycin购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。其他药品均为国产色谱纯或分析纯，实验用水均为超纯水。
1.2 细胞株和实验动物 人乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。C57BL/6 小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄；BALB/C-nu/nu裸鼠，SPF级，雄性，6～8周龄，实验动物购自上海BK公司。
1.3 方法
1.3.1 纳米颗粒的制备。
1.3.1.1 人血清白蛋白纳米颗粒（HSANP）。将人血清白蛋白储存液稀释后加入30% （V/V） DMSO溶液，搅拌混匀5 min（500 r/min），静置可得人血清白蛋白纳米颗粒溶液，冷冻干燥机处理48 h后去除溶液中的水和DMSO，得到人血清白蛋白纳米颗粒冻干粉末。
1.3.1.2 包埋紫杉醇/多西紫杉醇的纳米颗粒。将人血清白蛋白储存液稀释后加入适量以DMSO为溶剂的紫杉醇/多西紫杉醇溶液，最终体系中人血清白蛋白和紫杉醇/多西紫杉醇的摩尔比为1∶10，DMSO的量维持在30% （V/V），搅拌混匀5 min（500 r/min），静置可得包埋紫杉醇/多西紫杉醇纳米颗粒溶液，冷冻干燥机处理48 h后去除溶液中的水和DMSO，可得冻干粉末，复溶后离心30 min（10 000 r/min），取上清液再次冷冻干燥即可得包埋紫杉醇纳米颗粒粉末（HSANP-PTX）和包埋多西紫杉醇纳米颗粒粉末（HSANP-DOC）。
1.3.2 细胞培养和药物作用。将
细胞置于10% 胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞。所有实验药物以生理盐水为溶剂，配成储备液，在使用前，直接用培养基稀释到设定浓度，以生理盐水为空白对照组。
1.3.3 细胞毒性实验。
细胞毒性实验采用CCK-8法[8-9]：取对数生长期细胞，用0.025%胰蛋白酶消化后重悬、DMEM培养基稀释至100个/μL；将细胞种于96孔培养板中，每孔50 μL，加入DMEM稀释的药物50 μL，在未计入培养基的孔中补加100 μL 缓冲液；将培养板放入CO2培养箱中培养48 h，取出后每孔加入CCK-8溶液10 μL孵育1 h；在450 nm波长下检测OD值，通过公式（1）计算CSR。
CSR=ODtest-ODblankODcontrol-ODblank×100%（1）
1.3.4 荷瘤裸鼠模型的建立。
将对数期的MCF-7细胞制备成1.0×107个/mL的单细胞悬液，取6～8周龄裸鼠，于左前肢腋下皮下注射细胞悬液0.2 mL，建立皮下移植瘤裸鼠模型，建模后继续在人工光照环境下喂养，肿瘤体积达200 mm3时待用。
1.3.5 C57BL/6小鼠给药方案。
将C57BL/6小鼠分为9组，每组10只。采取尾静脉注射给药，给药体积10 mL/kg，连续给药10 d，每次剂量相同。给药后观察小鼠30 min，记录小鼠进食、饮水、体温等情况，并分别于第1次给药前1 d和停药后第2天称取小鼠体重。
1.3.6 荷瘤裸鼠给药方案。将BALB/C-nu/nu裸鼠分为16组，每组6只。采取尾静脉注射给药，给药体积10 mL/kg，于接种后第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天给药，每次剂量相同。给药后观察裸鼠30 min，记录小鼠进食、饮水、体温等情况，并分别于第1次给药前1 d和停药后第2天称取小鼠体重。
1.4 数据统计 数据以均值±标准差表示，统计学比较采用双侧T检验，P<0.05表示差异有显著性统计学意义。
2 结果与分析
2.1 人血清白蛋白纳米颗粒载体的安全性评价
2.1.1 人血清白蛋白纳米颗粒载体的细胞毒理分析。
以人乳腺癌MCF-7细胞为模型，以市售制剂Taxol的溶剂CrEL[聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇（50∶50，V/V）]和Taxotere的溶剂T80[吐温-80和13%乙醇（25∶75，V/V）]为参照，对人血清白蛋白纳米颗粒载体的细胞毒性进行研究。由表1可知，在HSANP的所有处理组中，CSR均>90%，表明MCF-7细胞生长不受HSANP的影响。然而，在CrEL和T80中，MCF-7细胞生长明显受阻，且随着处理浓度的增大，CSR显著下降。该结果表明，人血清白蛋白纳米颗粒作为林源活性成分的载体，与助溶溶剂相比，其细胞毒性非常小。
2.1.2 人血清白蛋白纳米颗粒载体对C57BL/6小鼠生长的影響。HSANP 3个剂量组的小鼠给药后无异常，实验期间饮食、行为无明显改变，无死亡现象发生。而CrEL和T80的实验组中，中剂量给药后出现静卧、冷漠，30 min后基本恢复，高剂量组给药后出现昏厥，CrEL组有4只小鼠死亡，T80组有3只小鼠死亡，剩余小鼠30 min后逐渐恢复。所有小鼠给药前后体重的变化如表2所示，在人血清白蛋白纳米颗粒载体3个实验组中，小鼠体重在给药前后均未发生显著性变化，而在2种溶剂的不同剂量实验组中，小鼠体重在给药前后均发生了显著性变化，且随着剂量的增加，体重减轻现象愈加明显。由此可知，与助溶溶剂相比，人血清白蛋白纳米颗粒载体对小鼠的生长影响较小。 2.2 紫杉醇（多西紫杉醇）納米颗粒的安全性评价
荷瘤裸鼠对Taxol、Taxotere、HSANP-PTX和HSANP-DOC的MTD结果见表3，Taxol实验组中荷瘤裸鼠在30 mg/kg时给药后就表现出静卧、冷漠，在40 mg/kg时给药后昏厥，并有部分裸鼠（4/6）死亡，在50 mg/kg时所有裸鼠给药后立即死亡；Taxotere实验组中荷瘤裸鼠在30 mg/kg时给药后表现出静卧、冷漠，在40 mg/kg时给药后昏厥，并有部分裸鼠（3/6）死亡，在50 mg/kg时所有裸鼠给药后立即死亡；HSANP-PTX在30、40 mg/kg时给药后均表现正常，在50 mg/kg时，给药后出现静卧、冷漠，30 min后精神状态基本恢复；在60 mg/kg时出现昏厥，部分裸鼠（3/6）死亡。HSANP-DOC在30、40 mg/kg时给药后均表现正常，在50 mg/kg 时，给药后出现静卧、冷漠，30 min后精神状态基本恢复，其中有1只裸鼠给药后昏厥，30 min 后未恢复，发生死亡；在60 mg/kg时出现昏厥，部分裸鼠（4/6）死亡。
所有组别在给药前后体重的变化见图1。在市售制剂Taxol和Taxotere实验组中，2个较低剂量（20、30 mg/kg）裸鼠的体重在给药前后变化不显著，这与实验的实施方案有关，荷瘤裸鼠的给药是在裸鼠瘤体长至（200±20）mm3时进行，裸鼠称量的体重均为裸鼠本身体重加上瘤体重量。在较低剂量时，虽然药物Taxol和Taxotere对裸鼠生长有影响，但瘤体的增长导致最终体重未减轻或有所增加。在剂量增加至40、50 mg/kg时，体重减轻很明显（减轻量>10%）。在HSANP-PTX和HSANP-DOC实验组中，裸鼠体重也随剂量的增加而减少，但与Taxol和Taxotere相比，剂量的影响程
度要小，当剂量为30、40 mg/kg时，HSANP-PTX和HSANP-DOC实验组裸鼠的体重无显著性变化，当剂量增至50、60 mg/kg时，裸鼠体重明显减轻（>10%）。MTD定义为观察期内不引起动物死亡且动物体重减少不超过10%的最大剂量[10-11]。综上所述，对于裸鼠来说，市售制剂Taxol和Taxotere的MTD为30 mg/kg，这与文献报道的Taxol和Taxotere在小鼠上的MTD为20～40 mg/kg是符合的[12-14]，而HSANP-PTX和HSANP-DOC为40 mg/kg。
3 结论与讨论
为评价人血清白蛋白纳米颗粒作为载体应用于林源活性成分的安全性，展开了细胞实验和动物实验，并以市售制剂Taxol和Taxotere
为参照，研究了人血清白蛋白纳米颗粒载体对细胞生长和动物生存的影响。数据表明，与市售制剂中的溶剂相比，人血清白蛋白纳米颗粒载体不论是对MCF-7细胞还是对C57BL/6小鼠毒性作用都很小。林源活性成分紫杉醇和多西紫杉醇占据抗肿瘤药物市场植物提取物单品排名的前2位，具广谱抗肿瘤性，然而研究证明他们对正常人体组织也有毒性。因此，Taxol和Taxotere使用后对人体的伤害一部分是溶剂造成的，例如CrEL导致的超敏反应，而另一部分伤害与紫杉醇（多西紫杉醇）本身毒性有关。之前的研究表明，人血清白蛋白纳米颗粒载体对包埋的活性成分（紫杉醇和多西紫杉醇）有很好的缓释作用，从而可以降低紫杉醇/多西紫杉醇对机体组织的毒性[15-18]。由荷瘤裸鼠的最大耐受剂量实验数据表明，与Taxol和Taxotere相比，HSANP-PTX和HSANP-DOC的毒性要小，前者的MTD为30 mg/kg，后者为40 mg/kg，证明被纳米颗粒载体包埋后的紫杉醇/多西紫杉醇的毒性得到了缓解。
综上所述，对于林源活性成分紫杉醇和多西紫杉醇来说，与溶剂型制剂相比，由人血清白蛋白纳米颗粒载体包埋的制剂安全性更高。同时结合之前对于HSANP-PTX和HSANP-DOC抗癌活性的研究结果[18]，可得出结论：与溶剂型制剂相比，紫杉醇和多西紫杉醇的纳米颗粒制剂更具优势，具有很大的市场前景，也证明蛋白纳米载体在林源活性成分的应用研究中具有重要的推广价值。
参考文献
[1]
国家林业局.“十一五”国家科技支撑计划项目“商品林定向培育及高效利用关键技术研究”课题申请指南[Z].北京：国家林业局，2006.
[2] 国家林业局.2013年度引进国际先进林业科学技术项目申报指南[Z].北京：国家林业局，2013.
[3] WILSON B，SAMANTA M K，SANTHI K，et al.Chitosan nanoparticles as a new delivery system for the antiAlzheimer drug tacrine[J].Nanomedicine：Nanotechnology，biology and medicine，2010，6（1）：144-152.
[4] PODARALLA S，AVERINENI R，ALQAHTANI M，et al.Synthesis of novel biodegradable methoxy poly（ethylene glycol）zein micelles for effective delivery of curcumin[J].Molecular pharmaceutics，2012，9（9）：2778-2786.
[5] ZHANG Z H，WANG X P，AYMAN W Y，et al.Studies onlactoferrin nanoparticles of gambogic acid for oral delivery[J].Drug delivery，2013，20（2）：86-93. [6] INOUE K，TAKANO H，YANAGISAWA R，et al.Size effects of latex nanomaterials on lung inflammation in mice[J].Toxicology and applied pharmacology，2009，234（1）：68-76.
[7] FANG R，YANG S Z，WANG Y B，et al.Nanoscale drug delivery systems：A current review on the promising paclitaxel formulations for future cancer therapy[J].Nano brief reports and reviews，2015，10（5）：150310190305009.
[8] CHANG Y L，YANG S T，LIU J H，et al.In vitro toxicity evaluation of graphene oxide on A549 cells [J].Toxicology letters，2011，200（3）：201-210.
[9] CHEN J，LIN C R，YONG W，et al.Calycosin and genistein induce apoptosis by inactivation of HOTAIR/pAkt signaling pathway in human breast cancer MCF7 cells [J].Cellular physiology and biochemistry，2015，35（2）：722-728.
[10] YANG D B，LIU X Q，JIANG X G，et al.Effect of molecular weight of PGGpaclitaxel conjugates on in vitro and in vivo efficacy[J].Journal of controlled release，2012，161（1）：124-131.
[11] 李敏.紫杉醇-Pluronic P123復合型胶束给药系统的研究[D].济南：山东大学，2013.
[12] LE GARREC D，GORI S，LUO L，et al.Poly （Nvinylpyrrolidone）blockpoly （D，Llactide） as a new polymeric solubilizer for hydrophobic anticancer drugs：In vitro and in vivo evaluation[J].Journal of controlled release，2004，99（1）：83-101.
[13] WANG C，WANG Y J，WANG Y J，et al.Characterization，pharmacokinetics and disposition of novel nanoscale preparations of paclitaxel[J].International journal of pharmaceutics，2011，414（1/2）：251-259.
[14] KWON G S.Polymeric micelles for multipledrug delivery[M]//SVENSON S，PRUD′HOMME R K.Multifunctional nanoparticles for drug delivery applications：Imaging，targeting，and delivery.Boston，MA：Springer，2012：133-152.
[15] HOUGHTON P J，KURMASHEVA R T，KOLB E A，et al.Initial testing （stage 1） of the tubulin binding agent nanoparticle albuminbound （nab） paclitaxel （Abraxane） by the Pediatric Preclinical Testing Program （PPTP）[J].Pediatric blood & cancer，2015，62（7）：1214-1221.
[16] MOCAN L，MATEA C，TABARAN F A，et al.Photothermal treatment of liver cancer with albuminconjugated gold nanoparticles initiates Golgi ApparatusER dysfunction and caspase3 apoptotic pathway activation by selective targeting of Gp60 receptor[J].International journal of nanomedicine，2015，10：5435-5445.
[17] ZHAO M Z，LEI C N，YANG Y D，et al.Abraxane，the nanoparticle formulation of paclitaxel can induce drug resistance by upregulation of Pgp[J].PLoS One，2015，10（7）：1-19.
[18] FANG R，LIU B T，YANG S Z，et al.Design and biological evaluation of longterm sustained release taxanes loaded human serum albumin nanoparticles[J].Nanoscience and nanotechnology letters，2018，10：1-9.