【摘 要】
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为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(chorismatemutase/prephenate dehydratase CM/PDT)[EC5.4.99.5/EC4.2.1.51],通过相关菌种CM/PDT
【机 构】
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军事医学科学院放射医学研究所,北京,100850军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850;
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为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(chorismatemutase/prephenate dehydratase CM/PDT)[EC5.4.99.5/EC4.2.1.51],通过相关菌种CM/PDT氨基酸序列同源比较,寻找高度保守位点.用定点突变及PCR法构建突变酶M1(缺失304T、305G、Q306K)、M2(缺失W338)、M3(缺失301～386位氨基酸)、M329(E329A)和M374(C374A),野生型及各突变型基因与pET28a(+)载体连接后,表达融合蛋白.在非变性条件下,由TALON金属螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白.酶活性测定表明,突变体M3的PDT活性下降为野生型活性的29%,但保持了CM活性.突变体M374保持了CM,PDT两种酶的活性,突变体M1、M2、M329的CM,PDT活性有一定程度的提高.酶抗反馈抑制作用检测表明,突变体M3、M374解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用,M1、M2、M329部分解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用.与含野生型pheA基因的E.coliBL21菌株相比,含突变基因的E.coli BL21菌株对10 mmol/L的苯丙氨酸代谢类似物具有强的抗反馈抑制作用,其中M1,M2,M3对20mmol/L的类似物具有抗反馈抑制作用.
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