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摘要：目的 探讨恶性血液病患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及调节性T细胞的变化和临床意义。方法 收集46例在我院住院治疗的恶性血液病患者和20例健康对照者，回顾分析外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及调节性T细胞水平。结果 与对照组比较，病例组外周血CD4+细胞水平下降、CD8+细胞水平上升、CD4+/CD8+比例下降，差异均具有显著性（P<0.05）。白血病组、MM组、NHL组CD4+细胞水平均较对照组下降（P<0.05），MDS组较对照组无显著差异（P>0.05）。白血病组、MDS组、MM组、NHL组CD8+细胞水平均较对照组上升（P<0.05），CD4+/CD8+比例均较对照组下降（P<0.05）。与对照组相比，病例组CD4+CD25+CD127low调节性T细胞水平上升，差异具有显著性（P<0.05）。白血病组、MDS组、MM组、NHL组CD4+CD25+CD127low调节性T细胞水平均分别较对照组上升（P<0.05）。结论 恶性血液病患者免疫功能低下，调节性T细胞增加，抗肿瘤免疫抑制增强，与肿瘤疾病的发病机制相关。
关键词：CD4+、CD8+T淋巴细胞;调节性T细胞;恶性;血液病
T淋巴细胞是机体免疫系统中重要的组成部分，介导细胞免疫应答，参与免疫调节及细胞杀伤作用，其数量和功能上的改变在自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展中起重要作用。体内参与抗肿瘤作用的T细胞主要是CD4+T细胞和CD+8细胞毒性T细胞。调节性T细胞是CD4+T细胞亚群中的一种，其被激活后表面高表达CD25分子，在免疫应答中发挥负调节作用，影响肿瘤细胞的杀伤，近年来研究表明CD127low可作为CD4+CD25+调节性T细胞更特异性的标记。血液系统肿瘤通常存在免疫缺陷，发病率呈上升趋势，免疫紊乱及免疫抑制使得恶性血液病无法得到满意的预后。本文通过收集整理回顾性分析46例恶性血液病患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+CD25+CD127low调节性T细胞的变化，探讨其在患者体内的特点及临床意义。
1.资料与方法
本文收集整理46例在我院住院治疗的恶性血液病患者，其中白血病27例（急性髓系白血病16例，急性淋巴细胞白血病4例，慢性淋巴细胞白血病5例，慢性粒细胞白血病2例），骨髓增生异常综合征 7例，多发性骨髓瘤 8例，非霍奇金淋巴瘤 4例。其中男性24例，女性22例，年龄16-82岁，平均（55.41±17.36）岁。健康对照20例，其中男性11例，女性9例，年龄24-56岁，平均（38.60±10.09）岁。采用回顾性分析上述患者及健康对照者的CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞数据结果，比较其差异。统计采用SPSS19.0统计分析软件，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2.结果
病例组及健康对照组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+CD25+CD127low调节性T细胞结果见表1。根据表中数据分析，病例组与对照组比较，外周血CD4+细胞水平下降、CD8+细胞水平上升、CD4+/CD8+比例下降，差异均具有显著性（P<0.05）。其中白血病组、MM组、NHL组CD4+细胞水平均分别较对照组下降（P<0.05），MDS组较对照组无显著差异（P>0.05）。白血病组、MDS组、MM组、NHL组CD8+细胞水平均分别较对照组上升（P<0.05），CD4+/CD8+比例均较对照组下降（P<0.05）。病例组与对照组比较，CD4+CD25+CD127low调节性T细胞水平上升，差异具有显著性（P<0.05）。白血病组、MDS组、MM组、NHL组CD4+CD25+CD127low调节性T细胞水平均分别较对照组上升（P<0.05）。
表1 病例组和对照组CD4+、CD8+T淋巴细胞及调节性T细胞结果（`x±s）
n
CD4+（%）
CD8+（%）
CD4+/CD8+
CD4+CD25+CD127low（%）
病例组
46
26.28±11.12a
37.79±17.00b
0.83±0.47b
7.65±3.15b
Leukemia
27
26.14±12.67a
35.70±19.06a
0.88±0.49b
7.78±3.44b
MDS
7
29.67±9.50c
40.08±14.72a
0.89±0.54a
6.48±2.63a
MM
8
26.14±9.04a
40.28±16.07a
0.78±0.42b
8.03±3.07b
NHL
4
21.50±5.83b
42.91±6.85b
0.51±0.14b
8.00±2.55b
对照组
20
34.90±7.50
25.67±8.75
1.45±0.36
3.74±1.27
注：a与对照组比较，P<0.05;b与对照组比较，P<0.01;c与对照组比较，P>0.05
3.讨论 机体免疫在疾病的发生发展过程中起到重要作用，其中T淋巴细胞介导的细胞免疫起到关键作用。T淋巴细胞来源于骨髓的始祖T细胞，包括CD4+辅助T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞等。在机体抗肿瘤过程中，免疫功能的紊乱导致恶性肿瘤得以逃避机体免疫监视和攻击，从而呈恶性增长。血液系统肿瘤来源于机体造血组织恶性分化，相较其他系统肿瘤，与免疫系统关系更加紧密，白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤是当前最常见的几种恶性血液病。目前这些疾病诊断及评估均已提升至免疫学水平，一些免疫治疗也起到了一定的疗效。造血干细胞移植通过去除异常的造血组织，重建造血及免疫系统，是目前唯一可能根治血液系统恶性肿瘤的治疗方法。
在抗肿瘤免疫应答中，CD4+T细胞识别被抗原提呈细胞提呈的肿瘤细胞，分泌多种细胞因子，进而激活CD8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞等发挥效应，部分细胞因子可直接发挥杀肿瘤作用。CD8+T细胞经激活增殖分化为CD8+细胞毒性T细胞后，可特异性杀伤识别的肿瘤细胞，起到抗肿瘤作用。CD4+/CD8+比例可评估免疫平衡，比例倒置是免疫缺陷的重要指征。T淋巴细胞亚群的检测是临床常见的检测手段，本文结果表明，恶性血液病患者常伴有T细胞亚群数量上的改变，与正常对照相比，CD4+细胞数量下降、CD8+细胞数量上升，而CD4+/CD8+比例倒置。这说明虽然T淋巴细胞在抗肿瘤免疫中起关键作用，但一旦其数量及比例发生异常，反而无法正常发挥抗肿瘤作用，识别、激活及杀伤靶细胞的功能均下降，从而导致肿瘤的逃逸。在本文中，CD8+细胞数量的上升更加显著（P<0.01），考虑CD8+细胞的增多对机体免疫有抑制作用，CD8+细胞的功能可能存在缺陷。有研究指出抗原特异性CD8+T细胞在许多慢性感染及肿瘤的刺激下出现功能障碍及衰竭，表现为效应功能低下，持续表达抑制性受体，在转录水平上与正常的效应T细胞或记忆T细胞有很大不同[1]。NHL组CD4+/CD8+下降更为明显，考虑与其发源于淋巴造血组织有一定关系。
CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是一种CD4+T细胞亚群，该种细胞可直接与CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞接触，对上述效应细胞产生抑制作用，同时还分泌IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子，对机体免疫应答发挥负调节作用。调节性T细胞除表达CD4和CD25分子外，还高表达转录因子FoxP3，低表达CD127分子，FoxP3的表达与CD127低表达相关。研究表明CD4+CD25+CD127low标记法在检测外周血CD4+CD25+Treg中较CD4+CD25high、CD4+CD25+FoxP3+更为理想[2]。Treg水平在实体肿瘤患者中增高早有报道，本文结果表明，在恶性血液病患者包括白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征及非霍奇金淋巴瘤，外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg水平均明显增高，提示Treg在恶性血液病患者免疫抑制中起关键作用。在正常生理状态下，CD4+CD25+Treg维持自身免疫耐受，抑制自身反应性T细胞活化，防止自身免疫疾病。而在肿瘤状态下，这种免疫抑制的特性，可导致效应细胞的功能下降，对肿瘤细胞的杀伤减弱。同时，肿瘤组织还能通过趋化因子招募Treg，例如CCL22可结合Treg表面表达的趋化因子受体CCR4，从何使Treg迁移、聚集并蓄积，来逃避机体免疫[3]。在对AML的研究表明，外周血Treg的水平与预后相关，在初诊AML患者中，低Treg水平者对诱导化疗有更好的应答，而化疗后CR者Treg仍保持较高水平，提示Treg对常规化疗有耐受能力[4]。Beyer M等[5]的研究指出包含环磷酰胺、氟达拉滨的方案可减少甚至清除Treg的抑制作用。Bhattacharya K等[6]对急性B淋巴细胞白血病的研究表明，来源于患者的Treg对效应T细胞有更强的抑制作用，Treg水平及免疫抑制力随疾病进展而提高，经过MCP841方案化疗，Treg逐步下降，提示免疫抑制减轻。根据以上可以推测去除或下调Treg细胞的数量和功能或许是抗肿瘤的一项新策略，但是最新研究指出[7]，Treg不仅包含抑制肿瘤免疫的亚群（iTreg），还包含抑制炎症反应的亚群（nTreg），后者能维持自身免疫耐受。在Goodyear OC等[8]的一项研究中指出，AML患者在接受异基因造血干细胞移植术后，应用阿扎胞苷能增加Treg的数量，增强GVL作用而不伴随增加GVHD的风险。因此在将来的治疗中应区分Treg的这两个亚群，选择更合适的治疗方案而不是一味清除Treg，使抗肿瘤免疫和自身免疫获得平衡，才能更好的让患者获益。
综上，恶性血液病患者免疫功能低下，调节性T细胞水平增高，抗肿瘤免疫抑制增强，与肿瘤疾病的发病机制相关。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及调节性T细胞的检测对评估恶性血液病患者的免疫状态，判断疗效及预后有重要的指导作用。减少iTreg的抗肿瘤免疫抑制作用并维持nTreg的自身免疫耐受，是今后免疫治疗的一项新策略。鉴于机体免疫的复杂性，相关机制和方案的选择仍待进一步的研究。
参考文献：
[1]Angelosanto JM，Wherry EJ.Transcription factor regulation of CD8+ T-cell memory and exhaustion[J].Immunol Rev. 2010 Jul;236：167-75.
[2]王会平，翟志敏，张爱梅，等.CD4+CD25+CD127low识别人外周血CD4+CD25+调节性T细胞的优势[J].中国免疫学杂志，2008，24（12）：1059-1062.
[3]Nishikawa H，Sakaguchi S.Regulatory T cells in tumor immunity[J].Int J Cancer. 2010 Aug 15;127（4）：759-67. [4]Szczepanski MJ，Szajnik M，Czystowska M，et al.Increased frequency and suppression by regulatory T cells in patients with acute myelogenous leukemia[J].Clin Cancer Res. 2009 May 15;15（10）：3325-32.
[5]Beyer M1，Kochanek M，Darabi K，et al.Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25hi regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine[J].Blood. 2005 Sep 15;106（6）：2018-25.
[6]Bhattacharya K，Chandra S，Mandal C.Critical stoichiometric ratio of CD4（+）CD25（+）FoxP3（+）regulatory T cells and CD4（+）CD25（-）responder T cells influence immunosuppression in patients with B-cell acute lymphoblastic leukaemia.Immunology[J]. 2014 May;142（1）：124-39.
[7]Whiteside TL.Induced regulatory T cells in inhibitory microenvironments created by cancer[J].Expert Opin Biol Ther，2014 Oct;14（10）：1411-25.
[8]Goodyear OC1，Dennis M，Jilani NY，et al.Azacitidine augments expansion of regulatory T cells after allogeneic stem cell transplantation in patients withacute myeloid leukemia（AML）[J].Blood. 2012 Apr 5;119（14）：3361-9.
关键词：CD4+、CD8+T淋巴细胞;调节性T细胞;恶性;血液病
T淋巴细胞是机体免疫系统中重要的组成部分，介导细胞免疫应答，参与免疫调节及细胞杀伤作用，其数量和功能上的改变在自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展中起重要作用。体内参与抗肿瘤作用的T细胞主要是CD4+T细胞和CD+8细胞毒性T细胞。调节性T细胞是CD4+T细胞亚群中的一种，其被激活后表面高表达CD25分子，在免疫应答中发挥负调节作用，影响肿瘤细胞的杀伤，近年来研究表明CD127low可作为CD4+CD25+调节性T细胞更特异性的标记。血液系统肿瘤通常存在免疫缺陷，发病率呈上升趋势，免疫紊乱及免疫抑制使得恶性血液病无法得到满意的预后。本文通过收集整理回顾性分析46例恶性血液病患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+CD25+CD127low调节性T细胞的变化，探讨其在患者体内的特点及临床意义。
1.资料与方法
本文收集整理46例在我院住院治疗的恶性血液病患者，其中白血病27例（急性髓系白血病16例，急性淋巴细胞白血病4例，慢性淋巴细胞白血病5例，慢性粒细胞白血病2例），骨髓增生异常综合征 7例，多发性骨髓瘤 8例，非霍奇金淋巴瘤 4例。其中男性24例，女性22例，年龄16-82岁，平均（55.41±17.36）岁。健康对照20例，其中男性11例，女性9例，年龄24-56岁，平均（38.60±10.09）岁。采用回顾性分析上述患者及健康对照者的CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞数据结果，比较其差异。统计采用SPSS19.0统计分析软件，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2.结果
病例组及健康对照组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+CD25+CD127low调节性T细胞结果见表1。根据表中数据分析，病例组与对照组比较，外周血CD4+细胞水平下降、CD8+细胞水平上升、CD4+/CD8+比例下降，差异均具有显著性（P<0.05）。其中白血病组、MM组、NHL组CD4+细胞水平均分别较对照组下降（P<0.05），MDS组较对照组无显著差异（P>0.05）。白血病组、MDS组、MM组、NHL组CD8+细胞水平均分别较对照组上升（P<0.05），CD4+/CD8+比例均较对照组下降（P<0.05）。病例组与对照组比较，CD4+CD25+CD127low调节性T细胞水平上升，差异具有显著性（P<0.05）。白血病组、MDS组、MM组、NHL组CD4+CD25+CD127low调节性T细胞水平均分别较对照组上升（P<0.05）。
表1 病例组和对照组CD4+、CD8+T淋巴细胞及调节性T细胞结果（`x±s）
n
CD4+（%）
CD8+（%）
CD4+/CD8+
CD4+CD25+CD127low（%）
病例组
46
26.28±11.12a
37.79±17.00b
0.83±0.47b
7.65±3.15b
Leukemia
27
26.14±12.67a
35.70±19.06a
0.88±0.49b
7.78±3.44b
MDS
7
29.67±9.50c
40.08±14.72a
0.89±0.54a
6.48±2.63a
MM
8
26.14±9.04a
40.28±16.07a
0.78±0.42b
8.03±3.07b
NHL
4
21.50±5.83b
42.91±6.85b
0.51±0.14b
8.00±2.55b
对照组
20
34.90±7.50
25.67±8.75
1.45±0.36
3.74±1.27
注：a与对照组比较，P<0.05;b与对照组比较，P<0.01;c与对照组比较，P>0.05
3.讨论 机体免疫在疾病的发生发展过程中起到重要作用，其中T淋巴细胞介导的细胞免疫起到关键作用。T淋巴细胞来源于骨髓的始祖T细胞，包括CD4+辅助T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞等。在机体抗肿瘤过程中，免疫功能的紊乱导致恶性肿瘤得以逃避机体免疫监视和攻击，从而呈恶性增长。血液系统肿瘤来源于机体造血组织恶性分化，相较其他系统肿瘤，与免疫系统关系更加紧密，白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤是当前最常见的几种恶性血液病。目前这些疾病诊断及评估均已提升至免疫学水平，一些免疫治疗也起到了一定的疗效。造血干细胞移植通过去除异常的造血组织，重建造血及免疫系统，是目前唯一可能根治血液系统恶性肿瘤的治疗方法。
在抗肿瘤免疫应答中，CD4+T细胞识别被抗原提呈细胞提呈的肿瘤细胞，分泌多种细胞因子，进而激活CD8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞等发挥效应，部分细胞因子可直接发挥杀肿瘤作用。CD8+T细胞经激活增殖分化为CD8+细胞毒性T细胞后，可特异性杀伤识别的肿瘤细胞，起到抗肿瘤作用。CD4+/CD8+比例可评估免疫平衡，比例倒置是免疫缺陷的重要指征。T淋巴细胞亚群的检测是临床常见的检测手段，本文结果表明，恶性血液病患者常伴有T细胞亚群数量上的改变，与正常对照相比，CD4+细胞数量下降、CD8+细胞数量上升，而CD4+/CD8+比例倒置。这说明虽然T淋巴细胞在抗肿瘤免疫中起关键作用，但一旦其数量及比例发生异常，反而无法正常发挥抗肿瘤作用，识别、激活及杀伤靶细胞的功能均下降，从而导致肿瘤的逃逸。在本文中，CD8+细胞数量的上升更加显著（P<0.01），考虑CD8+细胞的增多对机体免疫有抑制作用，CD8+细胞的功能可能存在缺陷。有研究指出抗原特异性CD8+T细胞在许多慢性感染及肿瘤的刺激下出现功能障碍及衰竭，表现为效应功能低下，持续表达抑制性受体，在转录水平上与正常的效应T细胞或记忆T细胞有很大不同[1]。NHL组CD4+/CD8+下降更为明显，考虑与其发源于淋巴造血组织有一定关系。
CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是一种CD4+T细胞亚群，该种细胞可直接与CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞接触，对上述效应细胞产生抑制作用，同时还分泌IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子，对机体免疫应答发挥负调节作用。调节性T细胞除表达CD4和CD25分子外，还高表达转录因子FoxP3，低表达CD127分子，FoxP3的表达与CD127低表达相关。研究表明CD4+CD25+CD127low标记法在检测外周血CD4+CD25+Treg中较CD4+CD25high、CD4+CD25+FoxP3+更为理想[2]。Treg水平在实体肿瘤患者中增高早有报道，本文结果表明，在恶性血液病患者包括白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征及非霍奇金淋巴瘤，外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg水平均明显增高，提示Treg在恶性血液病患者免疫抑制中起关键作用。在正常生理状态下，CD4+CD25+Treg维持自身免疫耐受，抑制自身反应性T细胞活化，防止自身免疫疾病。而在肿瘤状态下，这种免疫抑制的特性，可导致效应细胞的功能下降，对肿瘤细胞的杀伤减弱。同时，肿瘤组织还能通过趋化因子招募Treg，例如CCL22可结合Treg表面表达的趋化因子受体CCR4，从何使Treg迁移、聚集并蓄积，来逃避机体免疫[3]。在对AML的研究表明，外周血Treg的水平与预后相关，在初诊AML患者中，低Treg水平者对诱导化疗有更好的应答，而化疗后CR者Treg仍保持较高水平，提示Treg对常规化疗有耐受能力[4]。Beyer M等[5]的研究指出包含环磷酰胺、氟达拉滨的方案可减少甚至清除Treg的抑制作用。Bhattacharya K等[6]对急性B淋巴细胞白血病的研究表明，来源于患者的Treg对效应T细胞有更强的抑制作用，Treg水平及免疫抑制力随疾病进展而提高，经过MCP841方案化疗，Treg逐步下降，提示免疫抑制减轻。根据以上可以推测去除或下调Treg细胞的数量和功能或许是抗肿瘤的一项新策略，但是最新研究指出[7]，Treg不仅包含抑制肿瘤免疫的亚群（iTreg），还包含抑制炎症反应的亚群（nTreg），后者能维持自身免疫耐受。在Goodyear OC等[8]的一项研究中指出，AML患者在接受异基因造血干细胞移植术后，应用阿扎胞苷能增加Treg的数量，增强GVL作用而不伴随增加GVHD的风险。因此在将来的治疗中应区分Treg的这两个亚群，选择更合适的治疗方案而不是一味清除Treg，使抗肿瘤免疫和自身免疫获得平衡，才能更好的让患者获益。
综上，恶性血液病患者免疫功能低下，调节性T细胞水平增高，抗肿瘤免疫抑制增强，与肿瘤疾病的发病机制相关。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及调节性T细胞的检测对评估恶性血液病患者的免疫状态，判断疗效及预后有重要的指导作用。减少iTreg的抗肿瘤免疫抑制作用并维持nTreg的自身免疫耐受，是今后免疫治疗的一项新策略。鉴于机体免疫的复杂性，相关机制和方案的选择仍待进一步的研究。
参考文献：
[1]Angelosanto JM，Wherry EJ.Transcription factor regulation of CD8+ T-cell memory and exhaustion[J].Immunol Rev. 2010 Jul;236：167-75.
[2]王会平，翟志敏，张爱梅，等.CD4+CD25+CD127low识别人外周血CD4+CD25+调节性T细胞的优势[J].中国免疫学杂志，2008，24（12）：1059-1062.
[3]Nishikawa H，Sakaguchi S.Regulatory T cells in tumor immunity[J].Int J Cancer. 2010 Aug 15;127（4）：759-67. [4]Szczepanski MJ，Szajnik M，Czystowska M，et al.Increased frequency and suppression by regulatory T cells in patients with acute myelogenous leukemia[J].Clin Cancer Res. 2009 May 15;15（10）：3325-32.
[5]Beyer M1，Kochanek M，Darabi K，et al.Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25hi regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine[J].Blood. 2005 Sep 15;106（6）：2018-25.
[6]Bhattacharya K，Chandra S，Mandal C.Critical stoichiometric ratio of CD4（+）CD25（+）FoxP3（+）regulatory T cells and CD4（+）CD25（-）responder T cells influence immunosuppression in patients with B-cell acute lymphoblastic leukaemia.Immunology[J]. 2014 May;142（1）：124-39.
[7]Whiteside TL.Induced regulatory T cells in inhibitory microenvironments created by cancer[J].Expert Opin Biol Ther，2014 Oct;14（10）：1411-25.
[8]Goodyear OC1，Dennis M，Jilani NY，et al.Azacitidine augments expansion of regulatory T cells after allogeneic stem cell transplantation in patients withacute myeloid leukemia（AML）[J].Blood. 2012 Apr 5;119（14）：3361-9.