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摘要：目的研究疏肝颗粒对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法采用CCl4小鼠急性肝损伤模型，疏肝颗粒按高、中、低剂量灌胃，连续8周，测定血清谷草转氨酶AST）、谷丙转氨酶（ALT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）的含量，并观察肝脏的病理组织学改变。结果疏肝颗粒中、高剂量组可显著降低小鼠血清AST、ALT含量，与肝损模型组比较，差异显著（P<0.01或P<0.05）；肝组织病理学改变较肝损模型组显著减轻。结论疏肝颗粒对CCl4致小鼠急性肝损伤具有保护作用。
关键词：疏肝颗粒；化学性肝损伤；保护作用
疏肝颗粒系由铁皮石斛、枳椇子、葛根、丹参、五味子等中药组成，具有疏肝清热，护肝利胆的功效，用于化学性肝损伤的辅助治疗，效果显著。为进一步探讨其作用机制，本实验采用四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型，观察疏肝颗粒对化学性肝损伤的作用，为扩大临床应用提供实验依据。
1材料
1.1药物与试剂
疏肝颗粒由光明食品集团云南宏晟生物制品有限公司提供，批号20130403，每g含原生药2.5g，成人日服10g，剂量为0.42g原生药/kg.d，实验用不含辅料的提取物，临用时配成1g/ml的混悬液；四氯化碳（CCl4，分子量153.82），分析纯试剂，上海长江化工厂生产，批号：20121025；花生油为山东鲁花集团生产；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。
1.2动物
昆明种小鼠，体质量18.2～22.0g，SPF级，50只，由昆明医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（滇）2011-0004；饲料由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（滇）2011-0005。环境条件：温度20～25℃，相对湿度40%～70%，动物喂食标准饲料，自由饮水和摄食。
1.3仪器
AU2700型生化分析仪、显微镜均为OLYMPUS产品；UV-1750紫外可见分光光度计，日本岛津产品；TD-25-WS型台式离心机，湖南湘仪实验仪器有限公司生产。
2方法
采用化学性急性肝损伤小鼠模型【1】、，取50只小鼠，雌雄各半，对小鼠进行适应性饲养1周后，按体质量随机分为5组（每组各10只），即正常对照组、肝损伤模型组、疏肝颗粒低、中、高剂量组（低、中、高剂量组灌胃给药剂量折合原生药分别为2.1g、4.2g和8.4g/kg .d，分别相当于临床剂量的5倍、10倍和20倍）。正常对照组和CCl4模型组灌胃给纯净水，每天1次，剂量1ml/10g.d，共12 d。第
12天除正常对照组腹腔注射等体积花生油外，其余各组腹腔注射含有0.08%CCl4的花生油，剂量为0.1ml/10g。末次给药24h后，各组小鼠禁食不禁水12h，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，打开腹腔，经下腔静脉取血，分离血清，室温静置1h后，于3000r/min离心15min，按试剂盒说明检测血清AST、ALT活性。取肝脏相同部位肝组织，用生理盐水按质量比1：9制备10%肝匀浆，于4℃3500r/min离心10min，取血清上清液，按试剂盒说明测定GSH-Px活性及MDA含量。取小鼠肝脏右叶相同位置肝组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝组织切片的病理变化。
统计分析采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（x（—）±s）表示，用t检验进行组间统计分析。
3 结果
3.1对CCl4致小鼠肝损伤血清AST、ALT活性的影响
注：与正常对照组比较，## P<0.01；与模型对照组比较，* P<0.05，** P<0.01
从表1可见：模型组小鼠血清ALT和AST水平明显升高，与正常对照组比较差异非常显著（P<0.01），说明CCl4致小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组比较，疏肝颗粒低剂量组血清ALT和AST水平有所降低，但无显著性差异；中、高剂量组血清ALT和AST水平均明显降低，高剂量组的效应尤其明显，具有显著性或极显著性差异（P<0.05或P<0.01），提示疏肝颗粒对CCI4急性肝损伤小鼠血清ALT和AST水平升高有明显的拮抗作用，呈一定的量效关系。
3.2对CCl4 致小鼠肝损伤肝组织匀浆中GSH-Px和MDA的影响
肝损伤模型组小鼠肝组织GSH-Px含量明显低于正常对照组，MDA含量显著高于正常对照组，两者与正常对照组比较差异均非常显著（P<0.01），表明肝损伤模型成功。疏肝颗粒各剂量组大鼠的肝组织GSH-Px含量均高于模型对照组，高剂量组与模型对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该受试样品具有提高CCl4小鼠急性肝损伤肝组织中GSH-Px含量的作用；疏肝颗粒各剂量组大鼠的肝组织MDA含量均低于肝损伤模型组，高剂量组与模型对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该制剂能不同程度地抑制CCl4小鼠急性损伤肝组织中MDA的升高，增强GSH-Px活性，具有很好的抗氧化及清除氧自由基的作用。
3.3对肝组织病理的影响
小鼠肝组织病理形态学观察结果显示，正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地湿润，柔软性，肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝索呈放射状排列，整齐而有规律，大小均匀，分界清楚，细胞核大而圆，核质分布均匀，核仁清晰；CCl4模型组小鼠肝细胞体积明显增大，包膜紧张，细胞脂肪变性，肝小叶界限不清，索状排列紊乱，细胞核被挤向细胞周边，部分细胞核体积缩小，可見点、片状坏死，伴有大量炎性细胞浸润，呈弥漫性气球样变，边缘钝而厚，表面黄褐色，肝细胞核消失。
疏肝颗粒给药中、高剂量组小鼠肝脏颜色红润，被膜光滑，质地接近正常肝细胞。与模型组比较，中、高剂量组大鼠肝细胞的脂肪变性、炎症反应都有明显减轻，肝细胞核周围脂肪空泡明显减少，炎性细胞浸润程度明显降低，肝小叶结构趋于清晰，细胞索排列较整齐，高剂量组接近正常组水平。提示疏肝颗粒对急性化学性肝损伤有一定的保护作用，且呈量效关系。 4讨论
CCl4肝损伤动物模型是研究化学性肝损伤的经典模型，CCl4 可选择性地损伤小叶中央区的肝细胞，引起脂质过氧化反应，破坏细胞膜结构，使肝细胞变性坏死，细胞内ALT、AST自由基渗入血液而活性增高[1]。MDA是一种脂质过氧化反应的次产物，可进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成物活性脂褐质，沉积于组织细胞中，破坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡。GSH-Px是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶，可通过特异性催化GSH-Px对氢化氧化物的还原反应，而消除细胞内有害的过氧化代谢产物，以阻断脂质过氧化连锁反应，从而对保护细胞代谢的正常进行起到重要作用[2]。本实验结果显示：疏肝颗粒三个剂量组能不同程度地降低CCl4引起的肝损伤小鼠血清中ALT、AST及肝匀浆MDA水平，能不同程度地增高肝损伤小鼠肝匀浆谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的水平，且对小鼠肝脏的病理学损伤也有明显改善。实验表明疏肝颗粒对急性化学性肝损伤具有显著的保护作用，其作用机制可能是通过提高GSH-Px等抗氧化物酶的活性，从而清除氧自由基，减轻脂质过氧化，保护肝细胞膜结构和功能的完整性，增强机体抗氧化能力，从而起到保护肝细胞的作用。
转氨酶是肝细胞损害的敏感标志，也是化学性物质所致肝损伤最敏感的指标，CCl4损害各种细胞器和酶的结构功能，导致各种肝损伤，血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）等指标升高【3】。本实验结果证实CCl4导致血清ALT、AST升高，并对肝组织结构、肝小叶、肝细胞造成一定损害。疏肝顆粒能显著降低CCl4 导致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的含量，尤其是高剂量组效果明显，与模型组比较，血清ALT、AST的含量降低差异非常显著（P<0.01），对血清MDA的含量降低也很明显（P<0.05）。肝组织病理学观察亦显示对肝损伤改善较为明显。该作用在大剂量时更明显，提示该制剂减轻化学性肝损伤的作用呈现一定的量效关系。
实验结果表明，疏肝颗粒对小鼠化学性性肝损伤具有较好的保护作用，这和临床上用于疏肝清热，护肝利胆，用于化学性肝损伤的辅助治疗是一致的。其深入的作用机制，有待于进一步研究。
参考文献：
[1]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2005：1346.
[2]李为，刘娟，刘干，等.橙皮苷对急性化学性肝损伤小鼠的保护作用及机制.安徽医科大学学报，2010，45（3）：346-350
[3]周可军，邓雅. 脂肝清胶囊对酒精性肝损伤的保护作用. 现代中西医结合杂志，2009，18（33）：4069
作者简介：周可军（1958—），男，汉族，中药学本科，高级工程师，执业药师，主要从事中药及保健品研究工作。
关键词：疏肝颗粒；化学性肝损伤；保护作用
疏肝颗粒系由铁皮石斛、枳椇子、葛根、丹参、五味子等中药组成，具有疏肝清热，护肝利胆的功效，用于化学性肝损伤的辅助治疗，效果显著。为进一步探讨其作用机制，本实验采用四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型，观察疏肝颗粒对化学性肝损伤的作用，为扩大临床应用提供实验依据。
1材料
1.1药物与试剂
疏肝颗粒由光明食品集团云南宏晟生物制品有限公司提供，批号20130403，每g含原生药2.5g，成人日服10g，剂量为0.42g原生药/kg.d，实验用不含辅料的提取物，临用时配成1g/ml的混悬液；四氯化碳（CCl4，分子量153.82），分析纯试剂，上海长江化工厂生产，批号：20121025；花生油为山东鲁花集团生产；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。
1.2动物
昆明种小鼠，体质量18.2～22.0g，SPF级，50只，由昆明医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（滇）2011-0004；饲料由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（滇）2011-0005。环境条件：温度20～25℃，相对湿度40%～70%，动物喂食标准饲料，自由饮水和摄食。
1.3仪器
AU2700型生化分析仪、显微镜均为OLYMPUS产品；UV-1750紫外可见分光光度计，日本岛津产品；TD-25-WS型台式离心机，湖南湘仪实验仪器有限公司生产。
2方法
采用化学性急性肝损伤小鼠模型【1】、，取50只小鼠，雌雄各半，对小鼠进行适应性饲养1周后，按体质量随机分为5组（每组各10只），即正常对照组、肝损伤模型组、疏肝颗粒低、中、高剂量组（低、中、高剂量组灌胃给药剂量折合原生药分别为2.1g、4.2g和8.4g/kg .d，分别相当于临床剂量的5倍、10倍和20倍）。正常对照组和CCl4模型组灌胃给纯净水，每天1次，剂量1ml/10g.d，共12 d。第
12天除正常对照组腹腔注射等体积花生油外，其余各组腹腔注射含有0.08%CCl4的花生油，剂量为0.1ml/10g。末次给药24h后，各组小鼠禁食不禁水12h，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，打开腹腔，经下腔静脉取血，分离血清，室温静置1h后，于3000r/min离心15min，按试剂盒说明检测血清AST、ALT活性。取肝脏相同部位肝组织，用生理盐水按质量比1：9制备10%肝匀浆，于4℃3500r/min离心10min，取血清上清液，按试剂盒说明测定GSH-Px活性及MDA含量。取小鼠肝脏右叶相同位置肝组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝组织切片的病理变化。
统计分析采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（x（—）±s）表示，用t检验进行组间统计分析。
3 结果
3.1对CCl4致小鼠肝损伤血清AST、ALT活性的影响
注：与正常对照组比较，## P<0.01；与模型对照组比较，* P<0.05，** P<0.01
从表1可见：模型组小鼠血清ALT和AST水平明显升高，与正常对照组比较差异非常显著（P<0.01），说明CCl4致小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组比较，疏肝颗粒低剂量组血清ALT和AST水平有所降低，但无显著性差异；中、高剂量组血清ALT和AST水平均明显降低，高剂量组的效应尤其明显，具有显著性或极显著性差异（P<0.05或P<0.01），提示疏肝颗粒对CCI4急性肝损伤小鼠血清ALT和AST水平升高有明显的拮抗作用，呈一定的量效关系。
3.2对CCl4 致小鼠肝损伤肝组织匀浆中GSH-Px和MDA的影响
肝损伤模型组小鼠肝组织GSH-Px含量明显低于正常对照组，MDA含量显著高于正常对照组，两者与正常对照组比较差异均非常显著（P<0.01），表明肝损伤模型成功。疏肝颗粒各剂量组大鼠的肝组织GSH-Px含量均高于模型对照组，高剂量组与模型对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该受试样品具有提高CCl4小鼠急性肝损伤肝组织中GSH-Px含量的作用；疏肝颗粒各剂量组大鼠的肝组织MDA含量均低于肝损伤模型组，高剂量组与模型对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该制剂能不同程度地抑制CCl4小鼠急性损伤肝组织中MDA的升高，增强GSH-Px活性，具有很好的抗氧化及清除氧自由基的作用。
3.3对肝组织病理的影响
小鼠肝组织病理形态学观察结果显示，正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地湿润，柔软性，肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝索呈放射状排列，整齐而有规律，大小均匀，分界清楚，细胞核大而圆，核质分布均匀，核仁清晰；CCl4模型组小鼠肝细胞体积明显增大，包膜紧张，细胞脂肪变性，肝小叶界限不清，索状排列紊乱，细胞核被挤向细胞周边，部分细胞核体积缩小，可見点、片状坏死，伴有大量炎性细胞浸润，呈弥漫性气球样变，边缘钝而厚，表面黄褐色，肝细胞核消失。
疏肝颗粒给药中、高剂量组小鼠肝脏颜色红润，被膜光滑，质地接近正常肝细胞。与模型组比较，中、高剂量组大鼠肝细胞的脂肪变性、炎症反应都有明显减轻，肝细胞核周围脂肪空泡明显减少，炎性细胞浸润程度明显降低，肝小叶结构趋于清晰，细胞索排列较整齐，高剂量组接近正常组水平。提示疏肝颗粒对急性化学性肝损伤有一定的保护作用，且呈量效关系。 4讨论
CCl4肝损伤动物模型是研究化学性肝损伤的经典模型，CCl4 可选择性地损伤小叶中央区的肝细胞，引起脂质过氧化反应，破坏细胞膜结构，使肝细胞变性坏死，细胞内ALT、AST自由基渗入血液而活性增高[1]。MDA是一种脂质过氧化反应的次产物，可进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成物活性脂褐质，沉积于组织细胞中，破坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡。GSH-Px是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶，可通过特异性催化GSH-Px对氢化氧化物的还原反应，而消除细胞内有害的过氧化代谢产物，以阻断脂质过氧化连锁反应，从而对保护细胞代谢的正常进行起到重要作用[2]。本实验结果显示：疏肝颗粒三个剂量组能不同程度地降低CCl4引起的肝损伤小鼠血清中ALT、AST及肝匀浆MDA水平，能不同程度地增高肝损伤小鼠肝匀浆谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的水平，且对小鼠肝脏的病理学损伤也有明显改善。实验表明疏肝颗粒对急性化学性肝损伤具有显著的保护作用，其作用机制可能是通过提高GSH-Px等抗氧化物酶的活性，从而清除氧自由基，减轻脂质过氧化，保护肝细胞膜结构和功能的完整性，增强机体抗氧化能力，从而起到保护肝细胞的作用。
转氨酶是肝细胞损害的敏感标志，也是化学性物质所致肝损伤最敏感的指标，CCl4损害各种细胞器和酶的结构功能，导致各种肝损伤，血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）等指标升高【3】。本实验结果证实CCl4导致血清ALT、AST升高，并对肝组织结构、肝小叶、肝细胞造成一定损害。疏肝顆粒能显著降低CCl4 导致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的含量，尤其是高剂量组效果明显，与模型组比较，血清ALT、AST的含量降低差异非常显著（P<0.01），对血清MDA的含量降低也很明显（P<0.05）。肝组织病理学观察亦显示对肝损伤改善较为明显。该作用在大剂量时更明显，提示该制剂减轻化学性肝损伤的作用呈现一定的量效关系。
实验结果表明，疏肝颗粒对小鼠化学性性肝损伤具有较好的保护作用，这和临床上用于疏肝清热，护肝利胆，用于化学性肝损伤的辅助治疗是一致的。其深入的作用机制，有待于进一步研究。
参考文献：
[1]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2005：1346.
[2]李为，刘娟，刘干，等.橙皮苷对急性化学性肝损伤小鼠的保护作用及机制.安徽医科大学学报，2010，45（3）：346-350
[3]周可军，邓雅. 脂肝清胶囊对酒精性肝损伤的保护作用. 现代中西医结合杂志，2009，18（33）：4069
作者简介：周可军（1958—），男，汉族，中药学本科，高级工程师，执业药师，主要从事中药及保健品研究工作。