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摘要：目的 观察参龙健脑胶囊对脑缺血损伤大鼠脑组织谷氨酸（Glu）、N-甲基D-天冬氨酸受体（NMDAR）表达的影响，探讨其神经保护机制。方法 结扎双侧颈总动脉制备缺血性脑损伤大鼠模型，模型成功后随机分为假手术组、模型组、脑复康组及参龙健脑胶囊低、高剂量组，参龙健脑胶囊低、高剂量组和脑复康组分别按照0.40、1.20、0.45 g/kg剂量给药，每日灌胃1次，连续28 d。采用比色法观察Glu在大鼠脑组织中的含量，免疫组化方法观察NMDAR亚单位NR1在海马区的表达。结果 与模型组大鼠比较，参龙健脑胶囊组大鼠脑组织中Glu含量明显降低（P<0.01，P<0.05），海马区NR1表达减少（P<0.01）。结论 参龙健脑胶囊对缺血性脑损伤的保护作用可能与其抑制脑缺血后脑组织中Glu的释放、减少NR1的表达密切相关。
关键词：参龙健脑胶囊；脑缺血；谷氨酸；N-甲基-D-天冬氨酸受体；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0042-02
缺血性脑血管病是中老年人多发的常见病，随着其发病率的增长，已成为危害人类健康的重要疾病之一。近年来，在对脑缺血损伤病理生理机制的研究中，“脑缺血损伤级联反应”这一概念的提出倍受重视[1]。“兴奋性毒性”被认为是脑缺血损伤级联反应的始动环节。在脑缺血缺氧后，神经细胞释放大量以谷氨酸（Glu）为代表的兴奋性氨基酸（EAA），通过激活其N-甲基-天冬氨酸受体（NMDAR，NR1是其主要功能亚单位），而引起神经细胞损伤，是其脑损伤机制之一。本实验通过观察参龙健脑胶囊对脑缺血损伤大鼠脑组织Glu、NMDAR亚单位NR1表达的影响，进一步探讨其神经保护机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠50只，鼠龄3个月，体质量180～220 g，本院动物实验中心提供，许可证号：SCXK（京） 2009-0007。
1.2 药物与试剂
参龙健脑胶囊（人参、淫羊藿、制何首乌、石菖蒲、远志、地龙、川芎等，本院中药房提供）；脑复康（吡拉西坦，石家庄中诺药业有限公司，批号09075103）；Glu试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100827），NR1免疫组织化学试剂（博士德生物工程有限公司）；二抗检测系统试剂盒（广谱，基因上海科技有限公司）；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100701）。
1.3 主要仪器
紫外可见光分光光度计UV-2550（日本岛津公司），恒温水浴箱，白洋台式离心机52A（北京白洋医用离心机有限公司），Dy89-1型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），包埋机（EG1140H LAICA）切片机（RM2135 LAICA）显微镜（0LYMPUS BX60）Image-Pro Plus 5.1图像分析软件。
2 实验方法
2.1 制备大鼠脑缺血模型
采用双侧颈总动脉永久性结扎法（2-VO）制备脑缺血模型[2]。大鼠术前禁食、禁水，l0%水合氯醛腹腔麻醉（30 mg/100 g）后，仰卧固定在操作台上，颈前部去毛，碘酒、酒精消毒后沿颈正中线切开，钝性分离皮下组织，在气管旁分离并结扎双侧颈总动脉后逐层缝合伤口。假手术组仅分离双侧颈总动脉而不结扎。在造模大鼠清醒后，按照Zea Longa等[3]的5级评分法，立即进行动物神经功能的评定：正常（0分）；对侧肢体屈曲（1分）；拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力（2分）；拖鼠尾后拉时，向对侧转圈（3分）；自发向对侧转圈或倾倒（4分）。选取神经功能评分2分以上者进入实验。
2.2 分组及给药
除假手术组（8只）外，其余造模后存活大鼠（29只）进行神经功能评分后，随机分为4组：参龙健脑胶囊低剂量组（7只）、参龙健脑胶囊高剂量组（8只）、脑复康对照组（7只）、模型组（7只）。在造模成功后第3日开始灌胃给药。将脑复康和参龙健脑胶囊在研钵中研碎，溶于0.9%氯化钠溶液当中，按照成人与鼠的体质量折算系数比公式（dB=dA×kB/kA）[4]计算，参龙健脑胶囊低、高剂量组分别按0.40、1.20 g/kg灌胃，脑复康组按0.45 g/kg灌胃，每日1次，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。连续灌胃28 d。
2.3 标本采集
大鼠给药28 d后，以1O%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，用生理盐水经左心室快速冲洗，待流出液体清亮后，在冰面上迅速断头取脑，左侧大脑分离大脑皮层，生理盐水冲洗后，称重，制备成10%的组织匀浆；右侧大脑甲醛固定后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
2.4 脑组织内谷氨酸含量的测定
采用考马斯亮蓝法对10%的脑组织匀浆进行蛋白定量测定后，严格按照Glu试剂盒说明步骤操作。
2.5 N-甲基-D-天冬氨酸受体免疫组化染色（两步法）
切片常规脱蜡过梯度酒精；以3%过氧化氢，室温5 min灭活内源酶；经微波炉加热抗原修复后滴加稀释后的一抗（兔抗NR1 1∶250），4 ℃湿盒内过夜；加入二抗后，置于湿盒中，37 ℃温箱内孵育30 min；滴加DAB工作液，室温孵育5～10 min，光镜下控制显色，水洗终止反应；苏木素衬染、盐酸酒精分化后反蓝；常规脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。阳性反应产物为棕黄色颗粒。每组随机取4个标本，每个标本选取3张，共12张切片，0LYMPUS显微镜观察并照像后，采用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件进行平均光密度测量。
3 统计学方法
数据以—x±s表示，采用SPSS13.0软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，并进行两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。 4 结果
4.1 谷氨酸测定结果（见表1）
5 讨论
脑组织缺血性损伤后，脑内氨基酸的代谢异常导致神经元损伤及神经功能障碍的病理机制受到越来越多学者的重视，“兴奋性毒性”学说的建立，为脑缺血损伤及脑功能减退的研究提供了新的思路。EAA是由2个羧基和1个氨基构成的酸性游离氨基酸，主要包括Glu、天冬氨酸（Asp）等，Glu在脑内含量较高，是中枢神经系统内的主要兴奋性神经递质之一。
Glu受体分为代谢型受体和离子型受体NR属于离子型受体的一类，包括NR1、NR2A-D、NR3几种亚单位，其中NR1是该受体的主要功能单位，它在中枢神经系统内广泛分布[5]。兴奋性毒性是指因EAA 激活其受体引起的神经元死亡，是脑缺血损伤级联反应的始动环节，被认为可能是所有下游事件的触发者[6]。脑缺血损伤造成的缺血缺氧使能量生成减少，导致神经元和神经胶质细胞去极化，抑制Glu的重新摄取，使细胞外Glu大量蓄积，刺激NMDA受体过度兴奋，引起离子通道病理性开放、钙离子大量内流，细胞内钙超载，造成细胞中毒死亡[7]。因此临床干预脑缺血损伤的可能途径之一是调控兴奋性氨基酸Glu的表达，阻断激活的Glu受体，保护缺血损伤的脑组织神经元。
缺血性脑血管病可归于中医的“中风”、“偏枯”等范畴。关于该病病机，古代医家多从“痰、瘀、虚”等方面立论，如《丹溪心法》认为“湿土生痰，痰生热，热生风”，《景岳全书》则认为本病“皆内伤积损颓败而然”，清代王清任更是力主“气虚血瘀”之说。现代医家多认为肾虚精亏是其主要发病基础，而气虚血瘀、脑络失畅是导致本病的发生的主要方面，益气活血、补肾填精为基本治法。参龙健脑胶囊由人参、制何首乌、淫羊藿、石菖蒲、远志、地龙、川芎等药物组成，具有益气活血、补肾填精、化痰醒脑的功效，用于缺血性脑血管病辨证属肾精不足、气虚血瘀痰阻者。
本实验研究结果显示，脑缺血模型组大鼠脑组织中Glu的含量和海马区NR1表达显著高于假手术组， 参龙健脑胶囊组大鼠脑组织中Glu的含量和海马区NR1表达较模型组明显降低，提示参龙健脑胶囊降低脑缺血模型大鼠脑组织中Glu的含量和减少海马区NR1的表达，对抗兴奋性毒性，保护缺血损伤的神经元，是其脑保护作用的可能机制之一。
参考文献：
[1] 廖维靖.脑缺血损伤的病理生理机制-损伤级联反应[J].国外医学：脑血管疾病分册，1998，6（4）：197-202.
[2] 叶翠飞，白容，刘汇波，等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆相关脑区血流量的影响[J].中国实验动物学报，1999，7（1）：23-25.
[3] Zea Longa E， Weinstein PR， Carlsons， et a1. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84-91.
[4] 徐叔云，卞如濂，陈修.中药药理研究方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2006：203.
[5] 王业梅，王键，胡建鹏.益气活血方对脑缺血大鼠脑组织Glu、GABA及NR1表达的影响[J].安徽中医学院学报，2010，29（1）：44-46.
[6] 廖维靖，范明，杨万同.天然药物对脑缺血损伤级联反应和再灌注的作用[J].中国中西医结合杂志，2002，22（l1）：876-878.
[7] 田金洲.血管性痴呆[M].北京：人民卫生出版社，2003：2.
（收稿日期：2011-10-14，编辑：华强）
关键词：参龙健脑胶囊；脑缺血；谷氨酸；N-甲基-D-天冬氨酸受体；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0042-02
缺血性脑血管病是中老年人多发的常见病，随着其发病率的增长，已成为危害人类健康的重要疾病之一。近年来，在对脑缺血损伤病理生理机制的研究中，“脑缺血损伤级联反应”这一概念的提出倍受重视[1]。“兴奋性毒性”被认为是脑缺血损伤级联反应的始动环节。在脑缺血缺氧后，神经细胞释放大量以谷氨酸（Glu）为代表的兴奋性氨基酸（EAA），通过激活其N-甲基-天冬氨酸受体（NMDAR，NR1是其主要功能亚单位），而引起神经细胞损伤，是其脑损伤机制之一。本实验通过观察参龙健脑胶囊对脑缺血损伤大鼠脑组织Glu、NMDAR亚单位NR1表达的影响，进一步探讨其神经保护机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠50只，鼠龄3个月，体质量180～220 g，本院动物实验中心提供，许可证号：SCXK（京） 2009-0007。
1.2 药物与试剂
参龙健脑胶囊（人参、淫羊藿、制何首乌、石菖蒲、远志、地龙、川芎等，本院中药房提供）；脑复康（吡拉西坦，石家庄中诺药业有限公司，批号09075103）；Glu试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100827），NR1免疫组织化学试剂（博士德生物工程有限公司）；二抗检测系统试剂盒（广谱，基因上海科技有限公司）；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100701）。
1.3 主要仪器
紫外可见光分光光度计UV-2550（日本岛津公司），恒温水浴箱，白洋台式离心机52A（北京白洋医用离心机有限公司），Dy89-1型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），包埋机（EG1140H LAICA）切片机（RM2135 LAICA）显微镜（0LYMPUS BX60）Image-Pro Plus 5.1图像分析软件。
2 实验方法
2.1 制备大鼠脑缺血模型
采用双侧颈总动脉永久性结扎法（2-VO）制备脑缺血模型[2]。大鼠术前禁食、禁水，l0%水合氯醛腹腔麻醉（30 mg/100 g）后，仰卧固定在操作台上，颈前部去毛，碘酒、酒精消毒后沿颈正中线切开，钝性分离皮下组织，在气管旁分离并结扎双侧颈总动脉后逐层缝合伤口。假手术组仅分离双侧颈总动脉而不结扎。在造模大鼠清醒后，按照Zea Longa等[3]的5级评分法，立即进行动物神经功能的评定：正常（0分）；对侧肢体屈曲（1分）；拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力（2分）；拖鼠尾后拉时，向对侧转圈（3分）；自发向对侧转圈或倾倒（4分）。选取神经功能评分2分以上者进入实验。
2.2 分组及给药
除假手术组（8只）外，其余造模后存活大鼠（29只）进行神经功能评分后，随机分为4组：参龙健脑胶囊低剂量组（7只）、参龙健脑胶囊高剂量组（8只）、脑复康对照组（7只）、模型组（7只）。在造模成功后第3日开始灌胃给药。将脑复康和参龙健脑胶囊在研钵中研碎，溶于0.9%氯化钠溶液当中，按照成人与鼠的体质量折算系数比公式（dB=dA×kB/kA）[4]计算，参龙健脑胶囊低、高剂量组分别按0.40、1.20 g/kg灌胃，脑复康组按0.45 g/kg灌胃，每日1次，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。连续灌胃28 d。
2.3 标本采集
大鼠给药28 d后，以1O%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，用生理盐水经左心室快速冲洗，待流出液体清亮后，在冰面上迅速断头取脑，左侧大脑分离大脑皮层，生理盐水冲洗后，称重，制备成10%的组织匀浆；右侧大脑甲醛固定后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
2.4 脑组织内谷氨酸含量的测定
采用考马斯亮蓝法对10%的脑组织匀浆进行蛋白定量测定后，严格按照Glu试剂盒说明步骤操作。
2.5 N-甲基-D-天冬氨酸受体免疫组化染色（两步法）
切片常规脱蜡过梯度酒精；以3%过氧化氢，室温5 min灭活内源酶；经微波炉加热抗原修复后滴加稀释后的一抗（兔抗NR1 1∶250），4 ℃湿盒内过夜；加入二抗后，置于湿盒中，37 ℃温箱内孵育30 min；滴加DAB工作液，室温孵育5～10 min，光镜下控制显色，水洗终止反应；苏木素衬染、盐酸酒精分化后反蓝；常规脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。阳性反应产物为棕黄色颗粒。每组随机取4个标本，每个标本选取3张，共12张切片，0LYMPUS显微镜观察并照像后，采用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件进行平均光密度测量。
3 统计学方法
数据以—x±s表示，采用SPSS13.0软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，并进行两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。 4 结果
4.1 谷氨酸测定结果（见表1）
5 讨论
脑组织缺血性损伤后，脑内氨基酸的代谢异常导致神经元损伤及神经功能障碍的病理机制受到越来越多学者的重视，“兴奋性毒性”学说的建立，为脑缺血损伤及脑功能减退的研究提供了新的思路。EAA是由2个羧基和1个氨基构成的酸性游离氨基酸，主要包括Glu、天冬氨酸（Asp）等，Glu在脑内含量较高，是中枢神经系统内的主要兴奋性神经递质之一。
Glu受体分为代谢型受体和离子型受体NR属于离子型受体的一类，包括NR1、NR2A-D、NR3几种亚单位，其中NR1是该受体的主要功能单位，它在中枢神经系统内广泛分布[5]。兴奋性毒性是指因EAA 激活其受体引起的神经元死亡，是脑缺血损伤级联反应的始动环节，被认为可能是所有下游事件的触发者[6]。脑缺血损伤造成的缺血缺氧使能量生成减少，导致神经元和神经胶质细胞去极化，抑制Glu的重新摄取，使细胞外Glu大量蓄积，刺激NMDA受体过度兴奋，引起离子通道病理性开放、钙离子大量内流，细胞内钙超载，造成细胞中毒死亡[7]。因此临床干预脑缺血损伤的可能途径之一是调控兴奋性氨基酸Glu的表达，阻断激活的Glu受体，保护缺血损伤的脑组织神经元。
缺血性脑血管病可归于中医的“中风”、“偏枯”等范畴。关于该病病机，古代医家多从“痰、瘀、虚”等方面立论，如《丹溪心法》认为“湿土生痰，痰生热，热生风”，《景岳全书》则认为本病“皆内伤积损颓败而然”，清代王清任更是力主“气虚血瘀”之说。现代医家多认为肾虚精亏是其主要发病基础，而气虚血瘀、脑络失畅是导致本病的发生的主要方面，益气活血、补肾填精为基本治法。参龙健脑胶囊由人参、制何首乌、淫羊藿、石菖蒲、远志、地龙、川芎等药物组成，具有益气活血、补肾填精、化痰醒脑的功效，用于缺血性脑血管病辨证属肾精不足、气虚血瘀痰阻者。
本实验研究结果显示，脑缺血模型组大鼠脑组织中Glu的含量和海马区NR1表达显著高于假手术组， 参龙健脑胶囊组大鼠脑组织中Glu的含量和海马区NR1表达较模型组明显降低，提示参龙健脑胶囊降低脑缺血模型大鼠脑组织中Glu的含量和减少海马区NR1的表达，对抗兴奋性毒性，保护缺血损伤的神经元，是其脑保护作用的可能机制之一。
参考文献：
[1] 廖维靖.脑缺血损伤的病理生理机制-损伤级联反应[J].国外医学：脑血管疾病分册，1998，6（4）：197-202.
[2] 叶翠飞，白容，刘汇波，等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆相关脑区血流量的影响[J].中国实验动物学报，1999，7（1）：23-25.
[3] Zea Longa E， Weinstein PR， Carlsons， et a1. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84-91.
[4] 徐叔云，卞如濂，陈修.中药药理研究方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2006：203.
[5] 王业梅，王键，胡建鹏.益气活血方对脑缺血大鼠脑组织Glu、GABA及NR1表达的影响[J].安徽中医学院学报，2010，29（1）：44-46.
[6] 廖维靖，范明，杨万同.天然药物对脑缺血损伤级联反应和再灌注的作用[J].中国中西医结合杂志，2002，22（l1）：876-878.
[7] 田金洲.血管性痴呆[M].北京：人民卫生出版社，2003：2.
（收稿日期：2011-10-14，编辑：华强）