【摘 要】
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根据已报道的葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从葡萄中扩增获得GVB外壳蛋白基因(cp),大小为594 bp。通过序列测定和分析,选取优势分离物
【机 构】
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中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心,
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根据已报道的葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从葡萄中扩增获得GVB外壳蛋白基因(cp),大小为594 bp。通过序列测定和分析,选取优势分离物GVB-JFL cp基因克隆到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化融合蛋白pET-GVB CP。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白获得过量表达,分子量约26 kD。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗血清。采用间接ELISA和dot-ELISA对抗血清特异性进行检测,结果表明,抗血清可与感染GVB的西方烟和葡萄样品发生阳性反应,与健康植株及感染同属另一种病毒葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)的样品不反应,阳性样品检测效价达1︰4 000,16个田间样品摩擦接种至烟草后有9个样品ELISA检测为阳性,表明制备的抗血清可用于GVB的特异性检测。
Primers were designed according to reported nucleotide sequence of Grapevine virus B (GVB). The GVB coat protein gene (cp) was amplified from grape by RT-PCR and the size was 594 bp. Through sequencing and analysis, the dominant gene isolate GVB-JFL cp was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a and transformed into E.coli BL21 (DE3). The fusion protein pET-GVB CP was induced by IPTG and purified. SDS-PAGE electrophoresis showed that the fusion protein was overexpressed and its molecular weight was about 26 kD. Antiserum was prepared by immunizing New Zealand white rabbits with purified protein as antigen. The results of antiserum detection by indirect ELISA and dot-ELISA showed that the antiserum reacted positively with the Western tobacco and grape samples infected with GVB, and both the healthy plants and the infection belonged to Grapevine virus A , GVA) samples did not react, the positive sample detection titer of 1: 4000, 16 field samples rubbed tobacco to 9 samples ELISA positive, indicating that the prepared antiserum can be used for GVB specific detection.
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