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摘要：本文通过设计试验，使用高效液色谱分析法对红景天属植物云南红景天、喜马红景天、四裂红景天、大花红景天以及互生红景天的红景天甙的具体含量进行了精确测定，最后得出测定结论。
关键词：红景天;红景天甙;高效液相色谱
红景天甙是红景天属植物的重要组成部分，该有效成分有很大的医用价值。但是有关测定红景属植物中红景天甙含量的测定报告少之又少，为研究测定红景属植物中的红景天甙含量，本文设计了一种基于HPLC的红景天甙测定方法。
1 红景天概述
红景天是一种具有明显药用价值的植物，一般生长于石隙、山坡草地、高山草甸以及向阳山坡的沙质土壤中。红景天属植物的环境适应能力较强，适合种植于冷凉温润的环境中，因此为保证红景天的成活率，种植人员应在气候冷凉、海拔较高、无霜期短以及夏季昼夜温差大的山区环境中将红景天属植物进行栽种。红景天适合在春季以及秋季进行播种，春季播种时间为三月下旬到四月上旬，秋季播种时间为九月中旬至冻结之前。由于红景天药用价值极高，因此常被人们大量种植。
2 试验药品、试剂和仪器
本文设计的实验的实验药品有红景天植物大红花红景天干燥根茎，该红景天经TLC检测为单一斑点，使用HPLC测定峰值情况单峰。实验试剂为甲醇、注射用水。甲醇的作用为收集63.5-64.5摄氏度的馏分，甲醇和注射用水都来自华西医科大学附属药厂。本实验的仪器为Waters 510 HPLC泵、Baseline 810色谱工作台、uBondapak ODS柱、Waters 484可变波长紫外检测器、超声波振荡器以及10uL Hamilton U6K进样器。其中Waters 510 HPLC泵、Baseline 810色谱工作台、uBondapak ODS柱以及Waters 484可变波长紫外检测器均来自美国Wates公司，超声波振荡器来自上海超声波制造厂，10uL Hamilton U6K进样器来自美国Hamilton厂[1]。
3 试验方法和试验条件
实验第一步为配制红景天甙对照品溶液。首先使用精密仪器称量红景天甙对照品20.0毫克，称量完毕后将红景天甙对照品放于10毫升容量中，使用准备好的甲醇将对照品溶解稀释到刻度，得到浓度为2.0毫克/每毫升的红景天甙对照品储备液，为保证储备液的质量，需要将之后将红景天甙对照品储备放置于冰箱中进行保存，这样只要将红景天甙对照品储备液进行稀释即可开始测试验。第二步，实验色谱条件。本试验的色谱条件为Waters uBondapak ODS柱，规格为3.9mm*300mm，10um。Waters uBondapak ODS柱的温度环境为室温环境，即需要将环境温度控制在10攝氏度到30摄氏度之间。与此同时，为保证试验结果2的准确性，需要将甲醇和水的比例控制在0.25左右，且要将液体流速控制在1.0mL/min。本试验设定的红景天甙检测波长为276纳米，建设试验定量参数为峰高H，该峰高可使用Baseline810色谱工作台测定得到。第三步，试验线性范围和最低检出限。首先取一定量的红景天甙对照品储备溶液，加入一定量的甲醇溶液，稀释成2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、80ng/mL、120ng/mL以及200ng/mL的红景天甙对照品溶液。在该条件下，分别进样10uL的红景天甙稀释液，测定峰高，每个稀释液测定三次峰高，计算平均峰高，并对绝对进样品平均峰值高进行回归分析。使用回归分析方法进行回归分析后，可得出回归方程为W=0.1402H-9.1187*γ=0.9999。将相关数据代入进行计算后，可得出的结论为：在20-2000ng范围内，H与W之间呈良好的线性关系。此后，使用该方法对红景天甙储备液信噪进行测定，得出信噪比为3：1，经过计算得到储备液中的红景天甙最低检出量为15ng。第四步，制备和测定红景天甙样品供试液。首先取一克红景天生药粉末、0.2克大花红景天各三份，使用精密称测定具体的质量。将红景天甙生药样品装入Soxhlet提取器中，之后往提取器中加入30毫升甲醇，进行连续回流提取，回流提取时间为两个小时。使用30毫升甲醇对大化红景天提取物进行超声处理，处理时间为一个小时。之后将两种提取液过滤，过滤后的滤液静置于50毫升容量瓶中，并加入适量的甲醇，将滤液稀释到刻度线，待容量瓶中的溶液稳定后，即完成了对红景天生药以及大化红景天提取物供试品溶液的制备。其次，根据制备液保时间要求和标准加入法的要求，使用Baseline810色谱工作台测定出红景天供试品溶液中的红景天甙峰峰高。该测定步骤的测定条件为为HPLC条件。同时由于红景天甙色谱峰保留时间只有十个小时，因此需要使用一种快速的分析方法对样品进行分析，这里可使用外标两全法对红景天甙样品进行有效分析，通过合理使用Baseline210色谱工作台，即可测定红景天甙提取物供试品溶液的具体峰高。峰高测定完毕后，使用上文得到的回归方程即可计算出红景天甙提取物供试品溶液中红景天甙的实际百分含量。使用建立的方法即可测定出十个样品液中的红景天甙含量。第五步，测定加样回收率和精密度。首先，使用精密仪器称量0.02克大花红景天药材以及0.02克大花红景天提取物。称量完毕后将不同量的红景天甙标准品加入进来，并按照测定流程对红景天甙含量进行测定。经过测定可知，大花红景天甙生药的回收率为97.14%，大花红景天甙提取物回收率为99.07%。其次，选取一定量的林芝红景天供试品溶液，按照标准的操作步骤对试品溶液进行测定，测定次数为九次，测定精密度为1.55%，取九次测定结果的平均值，作为林芝红景天甙的含量。经过测定可知，林芝红景天中的红景天甙的含量为97.11%。
4 试验结果与讨论
经过上述一系列的试验操作，可准确测定出红景天中的红景天甙的具体含量。首先，根据测定结果可以得出结论：质地坚实、主根粗壮的红景天生药含有大量的红景天甙，比如互生红景天以及大花红景天等。反之，主根细小、质地较差的红景天的红景天甙含量较低，比如云南红景天、喜马红景天等。与此同时，处于不同地区的同一种红景天的红景天甙含量也有所不同，比如不同海拔、气候等的不同红景天中的红景天甙含量有所差别，一般情况下，海拔高的地方红景天中的红景天甙含量较低，海拔低的地方的红景天中的红景天甙含量相对较高，比如帕里地区的红景天中的红景天甙含量仅为0.17%。其次，当甲醇：水=20：80的流动相流动速度为1.0毫升/每分钟时，红景天的容量因子为2.19，即K=2.19时，测定的结果最准确，最后通过分析和对比可知，K的最佳范围为2-5。与此同时，当甲醇与水的含量比为15比85时，Baseline810色谱工作台测出的红景天甙色谱峰会变宽，此时说明红景天甙与溶液中的杂质有交叉的现象。最后，本实验曾使用超声振荡提取法和超声法反复提取和制备红景天生药供试液，提取次数为四次。但是经过提取后的红景天药渣中仍含有一定量的红景天甙。由此表明使用该方法并不能完全提取出红景天药材中所有红景天甙，使用Soxhlet法即可完全提取出所有的红景天甙[2]。
结论
合理使用高效液色谱分析法能够有效测定出红景属植物中的红景天甙含量，且测定结果良好。因此，可以大范围使用该测定方法对红景属植物中的红景天甙含量进行测定。
参考文献
[1]罗敏婷，何海彤，伍志航.高效液相色谱法测定植物精油中双氯芬酸钠的含量[J].香料香精化妆品，2020（06）：26-28.
[2]吴学进，王明月，马晨等.QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定香蕉中8种植物生长调节剂残留[J].热带作物学报，2020，41（11）：2297-2304.
作者简介：
华蕾（1982.04——），性别：女，民族：汉族，籍贯：四川，职称：讲师，学历：研究生，研究方向：园林植物，设施园艺组培。
（新疆石河子职业技术学院 新疆 石河子 832000）
关键词：红景天;红景天甙;高效液相色谱
红景天甙是红景天属植物的重要组成部分，该有效成分有很大的医用价值。但是有关测定红景属植物中红景天甙含量的测定报告少之又少，为研究测定红景属植物中的红景天甙含量，本文设计了一种基于HPLC的红景天甙测定方法。
1 红景天概述
红景天是一种具有明显药用价值的植物，一般生长于石隙、山坡草地、高山草甸以及向阳山坡的沙质土壤中。红景天属植物的环境适应能力较强，适合种植于冷凉温润的环境中，因此为保证红景天的成活率，种植人员应在气候冷凉、海拔较高、无霜期短以及夏季昼夜温差大的山区环境中将红景天属植物进行栽种。红景天适合在春季以及秋季进行播种，春季播种时间为三月下旬到四月上旬，秋季播种时间为九月中旬至冻结之前。由于红景天药用价值极高，因此常被人们大量种植。
2 试验药品、试剂和仪器
本文设计的实验的实验药品有红景天植物大红花红景天干燥根茎，该红景天经TLC检测为单一斑点，使用HPLC测定峰值情况单峰。实验试剂为甲醇、注射用水。甲醇的作用为收集63.5-64.5摄氏度的馏分，甲醇和注射用水都来自华西医科大学附属药厂。本实验的仪器为Waters 510 HPLC泵、Baseline 810色谱工作台、uBondapak ODS柱、Waters 484可变波长紫外检测器、超声波振荡器以及10uL Hamilton U6K进样器。其中Waters 510 HPLC泵、Baseline 810色谱工作台、uBondapak ODS柱以及Waters 484可变波长紫外检测器均来自美国Wates公司，超声波振荡器来自上海超声波制造厂，10uL Hamilton U6K进样器来自美国Hamilton厂[1]。
3 试验方法和试验条件
实验第一步为配制红景天甙对照品溶液。首先使用精密仪器称量红景天甙对照品20.0毫克，称量完毕后将红景天甙对照品放于10毫升容量中，使用准备好的甲醇将对照品溶解稀释到刻度，得到浓度为2.0毫克/每毫升的红景天甙对照品储备液，为保证储备液的质量，需要将之后将红景天甙对照品储备放置于冰箱中进行保存，这样只要将红景天甙对照品储备液进行稀释即可开始测试验。第二步，实验色谱条件。本试验的色谱条件为Waters uBondapak ODS柱，规格为3.9mm*300mm，10um。Waters uBondapak ODS柱的温度环境为室温环境，即需要将环境温度控制在10攝氏度到30摄氏度之间。与此同时，为保证试验结果2的准确性，需要将甲醇和水的比例控制在0.25左右，且要将液体流速控制在1.0mL/min。本试验设定的红景天甙检测波长为276纳米，建设试验定量参数为峰高H，该峰高可使用Baseline810色谱工作台测定得到。第三步，试验线性范围和最低检出限。首先取一定量的红景天甙对照品储备溶液，加入一定量的甲醇溶液，稀释成2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、80ng/mL、120ng/mL以及200ng/mL的红景天甙对照品溶液。在该条件下，分别进样10uL的红景天甙稀释液，测定峰高，每个稀释液测定三次峰高，计算平均峰高，并对绝对进样品平均峰值高进行回归分析。使用回归分析方法进行回归分析后，可得出回归方程为W=0.1402H-9.1187*γ=0.9999。将相关数据代入进行计算后，可得出的结论为：在20-2000ng范围内，H与W之间呈良好的线性关系。此后，使用该方法对红景天甙储备液信噪进行测定，得出信噪比为3：1，经过计算得到储备液中的红景天甙最低检出量为15ng。第四步，制备和测定红景天甙样品供试液。首先取一克红景天生药粉末、0.2克大花红景天各三份，使用精密称测定具体的质量。将红景天甙生药样品装入Soxhlet提取器中，之后往提取器中加入30毫升甲醇，进行连续回流提取，回流提取时间为两个小时。使用30毫升甲醇对大化红景天提取物进行超声处理，处理时间为一个小时。之后将两种提取液过滤，过滤后的滤液静置于50毫升容量瓶中，并加入适量的甲醇，将滤液稀释到刻度线，待容量瓶中的溶液稳定后，即完成了对红景天生药以及大化红景天提取物供试品溶液的制备。其次，根据制备液保时间要求和标准加入法的要求，使用Baseline810色谱工作台测定出红景天供试品溶液中的红景天甙峰峰高。该测定步骤的测定条件为为HPLC条件。同时由于红景天甙色谱峰保留时间只有十个小时，因此需要使用一种快速的分析方法对样品进行分析，这里可使用外标两全法对红景天甙样品进行有效分析，通过合理使用Baseline210色谱工作台，即可测定红景天甙提取物供试品溶液的具体峰高。峰高测定完毕后，使用上文得到的回归方程即可计算出红景天甙提取物供试品溶液中红景天甙的实际百分含量。使用建立的方法即可测定出十个样品液中的红景天甙含量。第五步，测定加样回收率和精密度。首先，使用精密仪器称量0.02克大花红景天药材以及0.02克大花红景天提取物。称量完毕后将不同量的红景天甙标准品加入进来，并按照测定流程对红景天甙含量进行测定。经过测定可知，大花红景天甙生药的回收率为97.14%，大花红景天甙提取物回收率为99.07%。其次，选取一定量的林芝红景天供试品溶液，按照标准的操作步骤对试品溶液进行测定，测定次数为九次，测定精密度为1.55%，取九次测定结果的平均值，作为林芝红景天甙的含量。经过测定可知，林芝红景天中的红景天甙的含量为97.11%。
4 试验结果与讨论
经过上述一系列的试验操作，可准确测定出红景天中的红景天甙的具体含量。首先，根据测定结果可以得出结论：质地坚实、主根粗壮的红景天生药含有大量的红景天甙，比如互生红景天以及大花红景天等。反之，主根细小、质地较差的红景天的红景天甙含量较低，比如云南红景天、喜马红景天等。与此同时，处于不同地区的同一种红景天的红景天甙含量也有所不同，比如不同海拔、气候等的不同红景天中的红景天甙含量有所差别，一般情况下，海拔高的地方红景天中的红景天甙含量较低，海拔低的地方的红景天中的红景天甙含量相对较高，比如帕里地区的红景天中的红景天甙含量仅为0.17%。其次，当甲醇：水=20：80的流动相流动速度为1.0毫升/每分钟时，红景天的容量因子为2.19，即K=2.19时，测定的结果最准确，最后通过分析和对比可知，K的最佳范围为2-5。与此同时，当甲醇与水的含量比为15比85时，Baseline810色谱工作台测出的红景天甙色谱峰会变宽，此时说明红景天甙与溶液中的杂质有交叉的现象。最后，本实验曾使用超声振荡提取法和超声法反复提取和制备红景天生药供试液，提取次数为四次。但是经过提取后的红景天药渣中仍含有一定量的红景天甙。由此表明使用该方法并不能完全提取出红景天药材中所有红景天甙，使用Soxhlet法即可完全提取出所有的红景天甙[2]。
结论
合理使用高效液色谱分析法能够有效测定出红景属植物中的红景天甙含量，且测定结果良好。因此，可以大范围使用该测定方法对红景属植物中的红景天甙含量进行测定。
参考文献
[1]罗敏婷，何海彤，伍志航.高效液相色谱法测定植物精油中双氯芬酸钠的含量[J].香料香精化妆品，2020（06）：26-28.
[2]吴学进，王明月，马晨等.QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定香蕉中8种植物生长调节剂残留[J].热带作物学报，2020，41（11）：2297-2304.
作者简介：
华蕾（1982.04——），性别：女，民族：汉族，籍贯：四川，职称：讲师，学历：研究生，研究方向：园林植物，设施园艺组培。
（新疆石河子职业技术学院 新疆 石河子 832000）