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自2013年首次爆发H7N9禽流感（Avian influenza）以来,我国至少出现了五个波次的H7N9流行,给养禽业造成了重大的经济损失。与此同时,我国也是首次发现人感染H7N9禽流感病毒（Avian influenza viruses,AIVs）的事件,给公共卫生安全带来了严重的威胁。虽然,H7N9 AIVs在人类和禽类中已经得到了有效的控制,但其致病机理仍需进一步研究。流感病毒共有8个基因片段（包括PB1、PB2、PA、HA、NA、M1和NS1）,编码10种蛋白。然而,随着对流感病毒不断的深入了解,研究者们陆续鉴定出其他新的病毒蛋白,包括 PB1-N40、PB1-F2、M42、NS3、PA-X、PA-N155 和 PA-N182。其中,PA-X蛋白是一种融合蛋白,其包含PA基因N端的191个氨基酸和C端的61个或41个氨基酸。PA-X的C端是由核糖体+1移码所形成的重叠开放阅读框（X-ORF）的产物。自PA-X蛋白被发现以来,其功能已经在不同亚型的流感病毒（如H1N1、H5N1、H9N2、H1N1、H1N2、H3N2和H3N8）以及各种宿主动物模型（如小鼠、鸡、鸭、猪和犬）中被广泛研究。研究发现PA-X蛋白的主要功能是调控病毒毒力和抑制宿主蛋白的表达（“host-shutoff”）,而“host-shutoff”在调节宿主免疫应答中发挥重要的作用。有趣的是,虽然目前发现不同流感病毒亚型中的PA-X蛋白均具有“host-shutoff”活性,但与“host-shutoff””活性有关的流感病毒毒力和病毒的复制能力在不同亚型中的表现并不一致,有时甚至相反。最重要的是,目前,PA-X蛋白对H7N9亚型AIVs在哺乳动物中毒力的影响还未知。为了探索PA-X蛋白是否调控H7N9流感病毒毒力和调节病毒诱导宿主的天然免疫反应应答,本研究以一株高致病性H7N9亚型AIVs A/Chicken/Guangdong/GD15/2017（GD15PA）和其HA裂解位点致弱的低致病性H7N9亚型AIVs r15PA作为母本病毒,探究这两株母本病毒及其PA-X表达量下降的重组病毒在复制能力、聚合酶活性、对小鼠致病性和诱导宿主天然免疫应答方面的差异。随后,通过共转染报告基因的方法确定H7N9流感病毒PA-X发挥“host-shutoff”活性的功能区及关键的氨基酸位点。最后进一步探索这些影响PA-X“host-shutoff”活性的位点对小鼠致病性和宿主天然免疫应答的影响。与此同时,我们也探索了这些影响H7N9AIVs PA-X蛋白“host-shutoff”活性的关键位点是否也影响H5N1亚型AIVs PA-X蛋白的“host-shutoff”活性。本研究将进一步扩展对PA-X蛋白复杂化调控流感病毒致病性的理解,并鉴定新的影响PA-X“host-shutoff”活性的关键氨基酸位点。1.PA-X蛋白对H7N9亚型禽流感病毒在小鼠中毒力的影响为了探索PA-X对H7N9亚型AIVs在小鼠致病性中的影响,本研究系统比较了高致病性 H7N9 亚型 AIVs 病毒株 A/Chicken/Guangdong/GD15/2017 GD1 5PA 和其 HA 裂解位点致弱的重组病毒r15PA,及其PA-X表达量下降的重组病毒（GD15PAX-3、GD15PAX-5、r15PAX-3 和 r15PAX-5）在体内外复制、聚合酶活性、“host-shutoff”活性、小鼠致病性及诱导宿主天然免疫应答方面的差异。体外复制结果表明,与母本病毒GD15PA相比,PA-X表达量下降的重组病毒GD15PAX-3和GD15PAX-5在感染MDCK细胞后的24h和36h复制能力显著增强。此外,与母本病毒r15PA相比,PA-X表达量下降的重组病毒r15PAX-3在感染后36h、48h和60h的复制能力显著增强,而重组病毒r15PAX-5的复制能力则显著下降。聚合酶活性结果表明,与母本毒相比,所有重组病毒的聚合酶活性显著增强。另外,下调PA-X表达量后,重组病毒抑制GFP报告基因和海肾荧光素酶（pRL-TK）表达的能力显著下降,说明H7N9亚型AIVs PA-X蛋白具有“host-shutoff”活性。小鼠致病性结果表明,母本病毒和重组病毒对小鼠的毒力无显著差异。但重组病毒GD15PAX-3和r15PAX-5在小鼠体内的复制能力与母本病毒GD15PA和r15PA相比显著增强。从病毒对小鼠肺脏的病理损伤结果来看,母本毒和重组病毒均造成小鼠肺部组织出现肺泡出血、毛细血管肿胀和淋巴细胞浸润等病理变化。然而病理变化定量分析结果表明,各组之间均无明显差异。通过对小鼠肺脏中病毒感染诱导的先天性免疫应答结果的分析,发现GD15PAX-3重组病毒刺激宿主产生的MX-1的表达要高于母本病毒GD15PA;r15PAX-3和r15PAX-5重组病毒刺激宿主产生的CXCL11的表达要显著高于母本病毒r15PA;而重组病毒r15PAX-5刺激宿主产生的MIG CXCL9的表达要显著高于重组病毒r15PAX-3。与此同时,重组病毒GD15PAX-5和r15PAX-3引起宿主的总体天然免疫应答水平要高于其各自的母本病毒。因此,以上的实验结果表明PA-X可调节H7N9亚型AIVs在体内外的复制能力,但是不显著影响病毒对小鼠的毒力。此外,与其他亚型流感病毒相似,H7N9亚型AIVs PA-X具有“host-shutoff”活性。进一步证明了 PA-X在调控流感病毒的毒力中具有亚型或毒株的差异性,扩展了我们对PA-X蛋白复杂化调控流感病毒毒力的理解。2.PA-X蛋白“host-shutoff”功能区的鉴定及其对小鼠致病性的影响前一章中我们已经证实了 H7N9亚型AIVs的PA-X蛋白具有“host-shutoff”活性,为了进一步探索PA-X发挥“host-shutoff”活性的关键功能区,我们分别构建了基于PA-X N端和C端潜在功能区位点修饰的重组PA-X表达质粒,即位于PA-X N-端的pCAGGS-PAX-N1、pCAGGS-PAX-N2 和位于 C-端的 pCAGGS-PAX-C1、pCAGGS-PAX-C2。基于 4 种报告基因（pIFN-β-Fluc、pISRE-Fluc、GLUC 和 pRL-TK）,验证母本质粒pCAGGS-PAX和其突变质粒“host-shutoff”活性的差异。结果显示,突变质粒 pCAGGS-PAX-N1、pCAGGS-PAX-N2、pCAGGS-PAX-C1、pCAGGS-PAX-C2 的“host-shutoff”活性与母本质粒pCAGGS-PAX相比有显著差异性。随后我们将处于以上“host-shutoff”功能区的第94、96、97、100、115、194、198和203位氨基酸位点进行单点突变和组合突变,同时拯救其相应修饰的重组病毒。结果表明,位于PA-X N-端突变位点分别为941（Isoleucine,I）、100V（Valine,V）时,所对应的突变质粒pCAGGS-PAX和pCAGGS-PAX-N6的“host-shutoff”活性最强,其所对应的重组病毒GD15PAX-N6对小鼠的致病性与母本毒GD15PA相比显著增强;位于 PA-X C-端突变位点氨基酸分别为 194L（Leucine,L）、198R（Arginine,R）、203R（Arginine,R）时,所对应的突变质粒 pCAGGS-PAX-C1、pCAGGS-PAX-C3、pCAGGS-PAX-C4的“host-shutof”活性最强,其所对应的重组病毒除GD15PAX-C1外,与母本病毒GD15PA相比,GD15PAX-C3和GD15PAX-C4在体外的复制能力以及对小鼠的致病性也显著增强。以上结果表明,H7N9亚型AIVs PA-X蛋白的第941、100V、194L、198R和203R位位点是调控“host-shutoff”活性的关键位点。其中,第100V、198R和203R除显著调控“host-shutoff”活性外也同时显著调控病毒的复制能力和对小鼠的毒力。接下来,通过对第94、96、97、100、115、194、198和203位氨基酸位点进行组合突变,探索了这些影响PA-X“host-shutoff”活性的关键位点之间的联合作用。结果发现,当位于PA-X N-端的突变位点氨基酸为94I/100V,所对应的突变质粒pCAGGS-PAX-N6“host-shutoff”活性最强,其所对应的重组病毒GD15PAX-N6在体内外的复制能力和对小鼠的致病性与母本病毒GD15PA相比显著增强;当位于PA-X C-端的突变位点氨基酸为194P/198R/203R时,所对应的突变质粒pCAGGS-PAX-C2“host-shutoff”活性最强,其对应的重组病毒GD15PAX-C2在体内外的复制能力和对小鼠的致病性与母本病毒GD15PA相比显著增强。与此同时,与母本病毒GD15PA相比,重组病毒 GD15PAX-N3、GD15PAX-N6、GD15PAX-C2、GD15PAX-C3、GD15PAX-C4和GD15PAX-C6在小鼠体内也引起了更加广泛的病毒感染,对小鼠肺部造成更加严重的病理损伤。通过对小鼠肺脏中病毒感染诱导的天然免疫应答反应的结果进行分析,发现重组病毒GD15PAX-N3刺激宿主产生的CXCL9表达要显著低于母本病毒GD15PA;而重组病毒GD15PAX-C4刺激宿主产生的TNF-α、MIP-1β表达要显著低于母本病毒GD15PA。此外,GD15PAX-N3感染组引起宿主的总体天然免疫应答高于母本病毒;而重组病毒GD15PAX-C2、GD15PAX-C3、GD15PAX-C4感染组引起宿主的总体天然免疫应答低于母本病毒。因此,以上结果表明,当H7N9亚型AIVs PA-X蛋白的第94位、第100位联合突变时（94I/100V）、第194、198、203位联合突变（194P/198R/203R）时,其“host-shutoff”活性最强且显著增强重组病毒的复制能力和对小鼠的毒力以及对小鼠肺部组织的损伤。随后,为了确定H7N9亚型AIVs PA-X上发挥“host-shutoff”活性的关键氨基酸位点是否在其他流感亚型上具有相同的作用,我们将第941、100V、194L、198R和203R位氨基酸位点在H5亚型PA-X蛋白上进行相同位置的修饰。基于5种报告基因质粒（pIFN-β-Fluc、pISRE-Fluc、GLUC、pRL-TK 和 GFP）系统,验证母本质粒pCAGGS-CK10-PAX和其突变质粒“host-shutoff”活性的差异。结果表明,影响H7N9亚型AIVs PA-X“host-shutoff”活性的关键位点941和100V也影响H5N1亚型AIVs PA-X的“host-shutoff”活性,而 198R、203R 位点对 H5N1 亚型 AIVs PA-X 的“host-shutoff”活性不影响。有趣的是,194L的作用则与H7亚型恰好相反。综上,本研究新鉴定了影响H7N9亚型AIVs PA-X蛋白“host-shutoff”活性的关键位点（941、100V、194L、198R 和 203R）及功能区（94I/100V 和 194P/198R/203R）。并且进一步发现显著增强H7N9亚型AIVs PA-X蛋白“host-shutoff”活性的关键位点（100V、198R、203R）和组合位点（94I/100V、194P/198R/203R）也显著增强了病毒在体内外的复制能力和对小鼠的毒力。此外,影响H7N9“host-shutoff”活性的941和100V位点也同时影响H5N1亚型AIVs PA-X蛋白的“host-shutoff”活性。然而,198R和203R却不影响H5N1亚型AIVs PA-X蛋白的“host-shutoff”活性,推测PA-X蛋白的“host-shutoff”活性可能具有亚型或者毒株差异性。因此,本研究充实了对PA-X蛋白复杂化调控病毒毒力和蛋白功能的理解。