【摘 要】
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细菌抗生素耐药性严重威胁着人类和动物的健康。尤其是质粒介导的耐药性在水平方向上的传播,使危害范围不断扩大。质粒的接合转移可受某些物质促进或抑制的影响。其中促进接合转移的物质均有使细胞膜通透性增强的特性。而多肽类药物多粘菌素E和万古霉素发挥抗菌效力的机制便是影响细胞膜的通透性。基于此,我们预测多肽类药物可能会对质粒的接合转移产生影响,进而影响耐药基因的水平传播。因此我们建立了质粒的接合转移模型,并探
【基金项目】
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国家重点发计划专项“畜禽重要病原耐药性检测与控制技术研究”（编号:2016YFD0501310 2016YFD0501310）； 国家自然科学基金基于体内PK/PD同步模型的达氟沙星对鸡毒支原体、大肠杆菌混合感染防耐药突变研究（编号:31702291）； 江苏高校优势学科建设工程资助项目；
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细菌抗生素耐药性严重威胁着人类和动物的健康。尤其是质粒介导的耐药性在水平方向上的传播,使危害范围不断扩大。质粒的接合转移可受某些物质促进或抑制的影响。其中促进接合转移的物质均有使细胞膜通透性增强的特性。而多肽类药物多粘菌素E和万古霉素发挥抗菌效力的机制便是影响细胞膜的通透性。基于此,我们预测多肽类药物可能会对质粒的接合转移产生影响,进而影响耐药基因的水平传播。因此我们建立了质粒的接合转移模型,并探索了这两种药物对接合转移的影响,同时使用野生型质粒对其功能进行了验证,最后初步探索了多粘菌素E和万古霉素影响质粒转移的潜在机制。用E.coli J53作为受体菌及携带RP4-7质粒的E.coli DH5α为供体菌,建立质粒接合转移模型。然后用不同亚抑菌浓度的多粘菌素E和万古霉素分别处理RP4-7质粒的接合转移过程。结果显示,多粘菌素E浓度为1/8MIC时,质粒接合频率达9.84×10-4,是空白对照的38倍;万古霉素浓度为1/4MIC时,质粒的接合频率提高了 3倍,达到8.67×10-5。上述数据说明,亚抑菌浓度的多黏菌素E和万古霉素可促进RP4-7质粒的接合转移。为了解药物在临床中对接合转移的影响,测定了药物对携带重要耐药基因的野生型质粒IncI2质粒（携带mcr-1基因）和IncX3质粒（携带blaNDM-5基因）接合转移的影响。结果显示,多黏菌素E在1/4MIC和1/8MIC浓度时,可显著提高IncI2质粒和IncX3质粒的接合频率,尤其是IncI2质粒的接合频率被提高了超过10倍。万古霉素对IncX3质粒的转移无影响,在1/8MIC浓度下对IncI2质粒的接合频率提高了近10倍。为初步探索多黏菌素E和万古霉素影响质粒转移的机制。首先通过扫描电镜观察到药物处理后的细菌表面有局部破损。然后用荧光探针PI和NPN对细胞膜通透性检测,发现药物作用下的细菌细胞膜通透性增加。其次,还测定了药物作用后细菌细胞内ROS的变化情况,发现万古霉素在1/4MIC时引起受体菌（E.coli J53）内ROS含量增加。最后,我们应用qPCR技术从分子层面分析了药物作用后细菌内部相关基因的表达变化。ompC和ompF基因分别编码了与渗透压有关的外膜孔蛋白,在低渗条件下ompF表达量增加,ompC则相反。基因表达测定结果显示ompC和ompF的表达分别呈现相对的下调和上调,这与用荧光探针检测的细胞膜通透性增加的结果一致,都说明细胞膜通透性增加。同时对调控细菌间形成连接的trbBp基因,以及抑制trbBp基因表达的质粒转移整体调控基因（korA、korB、trbA）的表达变化进行测定。实时荧光定量结果显示,korA、korB、trbA等基因表达下调,trbBp的表达呈上调趋势。因此说明药物抑制整体调控基因的表达,从而促进trbBp调控细菌间形成连接。综上所述,亚抑菌浓度下多黏菌素E和万古霉素能够促进质粒转移,其主要原因是药物对细胞膜形态产生影响且增加了细菌细胞膜通透性,其次是在药物作用下与质粒转移相关基因的表达发生变化,尤其是药物对细菌间形成接合配对关系有关的基因表达有促进作用。本次研究证明了亚抑菌浓度多黏菌素E和万古霉素对质粒在大肠杆菌中的转移有促进作用。提示亚抑菌浓度多肽类药物不但对相应耐药基因产生富集作用,也可能通过促进质粒的接合转移而加速其他类耐药基因的传播,结果为相关药物风险评估提供相应数据。同时提示我们应该加强相应药物的管控,及残留监测,避免耐药性的传播。
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