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B亚基(Calcineurin subunit B,CNB)是钙调蛋白磷酸酶CN的调节亚基,在信号转导通路中,能通过激活CNA的磷酸酶活性,引起一系列对底物的脱磷酸化作用。本课题组之前对于CNB的药效药理的研究,发现CNB可以刺激小鼠的非特异性免疫功能,同时还具有抑制肿瘤的功能。据此,我们推测CNB在体内可能行使一种尚未发现的新功能,发挥潜在的细胞调节作用。
为了探索CNB的新功能,本研究利用酵母双杂交技术,以CNB的全长结构为诱饵,对人U937细胞系的cDNA文库进行了筛选。通过氨基酸缺陷培养基(缺Leu、Trp、His、Ade)的筛选以及β-半乳糖苷酶活性的检测,共获得274个阳性克隆。接着对阳性载体携带的DNA片段进行测序比对,得到了16种基因。最后,采用体外GST Pull—down进一步验证筛选结果,最终筛选到了四种可能与CNB相互作用的蛋白,包括蛋白酶体亚基、活性氧调控蛋白、核糖体蛋白、电子传递蛋白等,为深入了解CNB的新功能提供了研究方向。
A亚基(Calcineurin subunit A,CNA)作为钙调蛋白磷酸酶的催化亚基,能被钙调素和CNB激活,催化特定底物的脱磷酸化。CNA根据结构和功能的特点可划分为5个部分:N端结构域、催化结构域、B亚基结合结构域(BBH)、钙调素结合结构域(CBD)和自抑制区(AID)。尽管我们已经得到了几个CN相关的三维晶体结构,但是还未获得CN与CaM或与底物结合的晶体结构信息,因此,关于CaM是如何激活CN,CN义是如何作用于底物的问题仍然没有答案。
为了深入的研究CaM如何与CN(主要是CBD)结合,这种信息又是如何传递到活性中心,进而影响酶与底物的结合。在前期工作和CN晶体结构的基础上[1-3],我们尝试构建了①CBA482(CaM与CN融合蛋白CBA的剪切突变体),②BA482(CN单链全酶融合蛋白BA的剪切突变体),③BA482-N150D(活性位点突变的BA482),用于晶体研究,希望解出CN与CaM结合的结构,以及CN与底物结合的结构。