【摘 要】
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目的: 1.探讨血管紧张素Ⅱ1型受体的激活/阻断对Aβ分泌的影响; 2.探讨血管紧张素Ⅱ1型受体的激活/阻断对PS1蛋白表达及β-/γ-分泌酶活性的影响。 方法: 1.利用
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目的: 1.探讨血管紧张素Ⅱ1型受体的激活/阻断对Aβ分泌的影响; 2.探讨血管紧张素Ⅱ1型受体的激活/阻断对PS1蛋白表达及β-/γ-分泌酶活性的影响。 方法: 1.利用真核表达质粒pcDNA3.1-AT1R以阳离子脂质体方法转染APP-PS1-HEK293细胞，pcDNA3.1-EGFP为阴性对照，通过G418(600μg/ml)选择培养，建立稳定表达AT1R且分泌Aβ的HEK293细胞(AT1R-APP-PS1-HEK293);以RT-PCR、细胞免疫荧光及Western blot检测转染的AT1R-APP-PS1-HEK293细胞中AT1R的表达; 2.原代海马神经元的培养及流式细胞术鉴定其纯度; 3.MTT及流式细胞术(Annexin V/PI双重标记)检测不同浓度AngⅡ(0，10，100，1000nM)对两种细胞AT1R-APP-PS1-HEK293和原代海马神经元存活率/凋亡率的影响; 4.ELISA法检测不同浓度AngⅡ(0，10，100，1000nM)激活与Losartan(10μM)阻断AT1R对Aβ40及Aβ42分泌的影响; 5.Western blot检测AngⅡ(1000nM)激活与Losartan(10μM)阻断AT1R对PS1蛋白表达的影响; 6.荧光底物酶分析法检测不同浓度AngⅡ(0，10，100，1000nM)激活与Losartan(10μM)阻断AT1R后对β-分泌酶及γ-分泌酶活性的影响。 结果: 1.RT-PCR、细胞免疫荧光及Western blot显示pcDNA3.1-AT1R稳定转入APP-PS1-HEK293细胞，建立了稳定转染细胞系，成功的表达目的基因; 2.成功培养原代海马神经元，且纯度在95％以上; 3.不同浓度AngⅡ(0，10，100，1000nM)对两种细胞存活率/凋亡率均无明显影响; 4.AngⅡ(0，10，100，1000nM)作用于AT1R-APP-PS1-HEK293细胞24小时后，不能改变Aβ40及Aβ42的产生;作用于原代海马神经元时能引起Aβ40及Aβ42的产生有轻微增加趋势，但与对照组相比差异无统计学意义;Losartan(10μM)阻断AT1R后在两种细胞中均不能改变Aβ40及Aβ42的产生。 5.AngⅡ1000nM及Losartan10μM作用于AT1R-APP-PS1-HEK293细胞及原代海马神经元48小时后均不能改变其PS1蛋白表达水平; 6.AngⅡ(0，10，100，1000nM)及Losartan(10μM)作用于AT1R-APP-PS1-HEK293细胞及原代海马神经元48小时后对β-分泌酶及γ-分泌酶活性的表达无明显影响。 结论: 体外实验表明AngⅡ激活AT1R或Losartan阻断AT1R不能通过调节PS1表达或β-/γ-分泌酶活性对Aβ产生起调控作用。
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