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在环境中缺乏可利用的氮源时,鱼腥藻PCC7120大约每隔10个营养细胞分化出一个能固氮的异形胞,这种半规律的细胞分化图式使其成为研究原核生物细胞分化和一维图式形成的模式生物。蓝藻异形胞分化和图式的形成受很多基因的调控,其中hetR的编码产物是异形胞分化的主调控因子,两分子的HetR可以通过组成有DNA结合活性的同源二聚体来调控其它与异形胞分化相关的基因的表达。通过EMSA实验,杜野博士(2010)实验证明了HetR也可以与hetZ启动子上193bp的一个区域结合,并将HetR的识别区锁定在了40bp内。本研究进一步将这一识别位点界定在了15bp内,其中有12个碱基在hetP和hetZ启动子上保守。根据这个结果,进一步预测了patA、alr3234、alr0202和hepA上游的HetR识别区。EMSA和遗传学证据表明,HetR可以与预测的HetR识别区结合,可能调控这些基因的表达。
主要研究内容及结果如下:
第一,HetR对hetZ启动子的结合依赖于15bp的核心识别序列。以10bp为步长,对40bp的HetR识别区进行窗口缺失,制备了4个30bp的片段,再与HetR进行EMSA,将HetR的结合位点缩短到了30bp。通过与hetP上游HetR识别序列相比较,在这40bp的hetZ启动子区域找到了也在hetP中保守的24个碱基,将其分成7组进行碱基置换。使用分别带有7组点突变的193bphetZ启动子片段与HetR进行EMSA实验,证明其中4组突变为HetR的结合所必需的,即5-GGGTCTA-CCC--CA-3。
第二,HetR在体外可以以浓度依赖的形式与hetP、hetZ及hepA、patA、alr3234、alr0202和hetR上游预测的HetR识别区域结合。根据碱基置换得到的12个保守碱基,我们预测了hetR、patA、alr0202、alr3234和hepA上游的HetR识别区域。EMSA表明,HetR与hetP和hetZ上游的识别位点结合最强,与hepA和patA上游识别位点的结合能力次之,再次是alr3234上游的识别位点,对alr0202和hetR上游预测位点的结合最弱。
第三,HetR促进patA的表达。以gfp为报告基因,检测了hetR、patA、alr3234和alr0202上游预测的HetR识别位点对它们转录的影响。结果表明,HetR促进patA上游-305位起始的转录在营养细胞和异形胞中的表达,并且对于互补patA突变株是必需的。相反,alr3234和alr0202上游预测的HetR结合位点则可能在营养细胞或异形胞中抑制各自的表达。
本研究得出以下结论:HetR作为异形胞分化的主调控因子,除了直接调控hetP和hetZ的表达来参与异形胞发育的调控外,还直接调控patA的表达参与异形胞图式形成的调控;HetR既能做为正调控因子促进上述基因的表达,也能做为负调控因子抑制某些基因的表达。