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目的:
研究北京四所大型综合性教学医院(以下简称“大型医院”)与北京四所中型医院(以下简称“中型医院”)临床分离的肠球菌对抗菌药物的耐药性及北京友谊医院临床分离的肠球菌的同源性和整合子在耐药播散中所起的作用。旨在了解肠球菌耐药特点及趋势，为临床治疗选药、流行病学调查，控制其播散等提供科学依据。
材料与方法:
1、第一部分菌株来源：收集2001年．2004年间，北京市四所大型综合性教学医院(首都医科大学附属北京友谊医院、朝阳医院，北京大学附属第一医院、人民医院)和北京四所中型医院(北京复兴医院、海淀医院、垂杨柳医院、第六医院)临床分离的肠球菌550株；第二部分菌株来源：首都医科大学附属北京友谊医院340株万古霉素敏感肠球菌和10株万古霉素耐药屎肠球菌：第三部分菌株来源：首都医科大学附属北京友谊医院多重耐药的324株粪肠球菌和66株屎肠球菌。全部实验菌株经自动微生物系统鉴定，使用CLSUNCCLS推荐的琼脂稀释法或纸片扩散法进行药敏试验及结果判定。以粪肠球菌ATCC29212、ATCC51299为质控菌株。使用WHONET 5.3软件对数据进行处理分析。
2、采用RAPD技术构建指纹图谱，对340株万古霉素敏感肠球菌和10株万古霉素耐药的屎肠球菌进行检测，确定菌株的亲缘关系。RAPD随机引物5’-CTGCTGGGAC-3’；PCR模板的制备：提取基因组DNA。
3、对10株万古霉素耐药的屎肠球菌携带的耐药基因进行检测。万古霉素耐药基因vanA引物：上游5’-GGGAAAACGACAATTGC-3’，下游5’-GTACAATGCGGCCGGT-3’。 PCR模板的制备：提取质粒DNA。
4、采用PCR方法对多重耐药的324株粪肠球菌和66株屎肠球菌进行整合子的检测，一类整合子(Class Ⅰ Integron)特异引物及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子的整合酶基因引物序列如下：
5-CS：5_GGC ATC CAA GCAAG-3
3-CS：5-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3
IntI1L：5-ACA TGT GAT GGC GAC GCA CGA-3
IntI1R：5-ATT TCT GTC CTG GCT GGC GA-3
IntI2L：5-CACGGATATGCGACAAAAAGGT-3
IntI2R：5-GTAGCAAACGAGTGACGAAATG-3
IntI3L：5-GCCTCCGGCAGCGACTTTCAG-3’
IntI3R：5-ACGGATCTGCCAAACCTGACT-3
质粒DNA的提取采用碱性裂解法。通过基因测序对PCR产物进行了验证。测序结果在GenebanK序列数据库进行基因同源性分析(BLASTN)。
携带一类整合子的肠球菌质粒接合转移试验：从含有一类整合子的肠球菌中选择了60株作为供体菌，其中40株粪肠球菌、20株屎肠球菌(试验菌株利福平MIC值均小于32μg/ml)，采用滤膜接合法进行了质粒接合转移试验。受体菌是由美国Don B.Clewell教授赠送的粪肠球菌JH2-2(利福平MIC>50μg/ml)。
结果:
1、中型医院与大型医院前四位的标本种类和排序是一致的，依次为尿液40.5﹪和35.7﹪、痰液20.5﹪和21.7﹪、脓性分泌物8.5﹪和9.7﹪、血液5.5﹪和6.0﹪。粪肠球菌和屎肠球菌所占的百分比，中型医院分别为56﹪和41.5﹪；大型医院分别为59.4﹪和35.4﹪。对青霉素、氨苄西林、左旋氧氟沙星、红霉素、四环素、氯霉素、利福平、万古霉素、庆大霉素、链霉素的耐药率，中型医院粪肠球菌分别为43.8﹪、24.1﹪、44.6﹪、87.5﹪、42.9﹪、44.6﹪、40.2﹪、1.8﹪、46.4﹪、50.0﹪；屎肠球菌分别为97.6﹪、73.5﹪、71.1﹪、92.8﹪、44.6﹪、60.2﹪、45.8﹪、1.2﹪、55.4﹪、53.0﹪；对以上几种抗菌药物的耐药率，大型医院粪肠球菌分别为60.1﹪、30.2﹪、47.6﹪、94.2﹪、42.3﹪、49.0﹪、79.8﹪、1.9﹪、56.7﹪、59.1﹪；屎肠球菌分别为99.2﹪、87.9﹪、75.0﹪、95.2﹪、42.7﹪、76.6﹪、78.2﹪、2.4﹪、66.1﹪、62.9﹪。
2、应用RAPD技术进行肠球菌同源性分析，对于万古霉素敏感肠球菌，有5组(每组内的菌株具有相同的指纹图谱)具有同源性。对于10株耐万古霉素屎肠球菌，其中4株菌具有相同的指纹图谱，具有同源性。
3、10株耐万古霉素屎肠球菌，都携带vanA基因。
4、整合子检测结果：324株粪肠球菌和66株屎肠球菌一类整合子的携带率分别为53.1﹪和51.5﹪；本次实验未检出二类、三类整合子。经核苷酸序列测定，一类整合子携带aadA2耐药基因；质粒接合转移试验结果：40株粪肠球菌和20株屎肠球菌中有95﹪(57/60)携带的一类整合子转移到受体菌中，接合子也同样携带一类整合子基因和一类整合酶基因。
结论:
1、肠球菌对多种抗菌药物具有较强耐药性，屎肠球菌对大多数抗菌药物耐药率均高于粪肠球菌。不同类型医院由于病人来源及使用的抗菌药物的种类、方式不同，出现对同一抗菌药物具有不同的耐药性。大型医院肠球菌对青霉素等抗菌药物的耐药性普遍高于中型医院。
2、指纹图谱相同的菌株具有同源性，可能是同一菌株在院内的传播，是医院感染菌株。RAPD技术可用于肠球菌的同源性分析。仅见少数同源性菌株，未见大型暴发流行。屎肠球菌万古霉素耐药主要由vanA介导。
3、一类整合子携带aadA2耐药基因(编码对链霉素和大观霉素的耐药性)，与肠球菌高耐庆大霉素、链霉素无关。由质粒携带的整合子可通过质粒播散耐药性。