【摘 要】
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[目的]目前,禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)在世界范围内多种动物中广泛流行,每一次严重的暴发都会造成巨大的经济损失。尤其是高致病性禽流感可导致高达100%发病率
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[目的]目前,禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)在世界范围内多种动物中广泛流行,每一次严重的暴发都会造成巨大的经济损失。尤其是高致病性禽流感可导致高达100%发病率和较高的死亡率,且其可直接感染人并致人以死亡。其在生态学和公共卫生学方面的意义已引起全世界人们的广泛关注。禽流感(Avian Influenza,AI)在我国很多地区普遍存在,并造成了严重的危害。为了减少损失,为我国在禽流感疫苗方面的进一步研究提供有力的基础,本研究构建能够表达虎源H5N1亚型流感病毒HA蛋白的重组犬2型腺病毒(canine type 2 adenovirus,CAV-2),其可以作为常规免疫,降低禽流感疫情的发生,增强我国禽流感的防控能力。[方法]应用常规分子生物学方法,构建能够表达A/Tiger/Harbin/132/2007 HA基因的真核表达载体pCAGGS-HA;运用间接ELISA和间接免疫荧光的方法检测其在哺乳动物细胞BHK-21中的瞬时表达情况；将pCAGGS-HA中含有HA表达盒的片段定向克隆入犬2型腺病毒载体pPoly2-CAV2的E3缺失区,获得在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2-HA。利用脂质体介导的转染方法,将重组质粒pCAV-2-HA导入DK细胞中；观察细胞的变化,待培养细胞出现典型的腺病毒样细胞病变时,对重组的病毒采用电镜进行形态学鉴定,利用血凝实验检测重组病毒的血凝性,应用RT-PCR的方法检测重组病毒在繁殖的过程中HA基因片段是否发生缺失以及能否正确转录HA基因的mRNA,采用间接免疫荧光和间接ELASA的方法检测HA基因在DK细胞中的表达情况和重组病毒体外遗传稳定性。[结果]成功构建了真核表达质粒pCAGGS-HA并且能在哺乳动物细胞BHK-21中表达具有生物活性的HA蛋白；CAV-2-HA重组病毒具有典型的CAV-2形态特征和血凝特性,并且能够转录HA基因的]mRNA,间接ELISA和间接免疫荧光检测表明所构建的重组病毒能够正确表达HA蛋白,且在体外具有良好的遗传稳定性。[结论]该实验成功构建了A/Tiger/Harbin/132/2007 HA基因重组犬2型腺病毒的载体pCAV-2-HA;转染出了能在哺乳动物细胞中表达具有生物活性的HA蛋白的重组病毒CAV-2-HA。
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