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目的本研究通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库初步分析miR-181c的表达与肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者预后存在明显相关性的基础上,评估超声微泡靶向爆破(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)法介导miR-181c干扰质粒(miR-181c-shRNA)转染人肝癌HepG2细胞的可行性并筛选最优超声转染条件;观察转染目的质粒后对HepG2细胞增殖和周期的影响,为进一步探讨miR-181c在HCC发病机制中的潜在作用及临床意义提供依据。方法1.下载TCGA中HCC患者数据集,分析miR-181c基因表达与HCC患者临床病理学特征的关系,以及对HCC患者生存时间及预后的影响。2.构建沉默miR-181c表达的干扰质粒miR-181c-shRNA。3.Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测不同浓度六氟化硫(SF6)微泡对人肝癌HepG2细胞活性的影响。4.UTMD法介导miR-181c-shRNA转染人肝癌HepG2细胞,筛选最优的超声辐照转染条件,包括微泡浓度、辐照时间、机械指数(MI)。5.利用最优条件介导miR-181c-shRNA转染人肝癌HepG2细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)检测转染后miR-181c的表达情况。6.CCK8法检测沉默miR-181c表达后细胞增殖情况,流式细胞仪检测沉默miR-181c表达后细胞周期情况。结果1.TCGA数据库分析结果提示miR-181c异常表达与HCC患者的临床分期、肿瘤浸润程度有关,差异有统计学意义(P<0.05);miR-181c高表达患者的无病生存期较miR-181c低表达患者明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),而总生存期相比较差异无统计学意义(P>0.05);Cox比例风险模型的单变量及多变量分析结果提示miR-181c表达是HCC中的独立预后因素(P<0.05)。2.设计miR-181c沉默表达载体shRNA引物序列,miRNA沉默表达载体经限制性内切酶Eco R1-HF和Bam H1-HF酶切并连接shRNA,转化并提取质粒经过电泳及测序,鉴定质粒miR-181c-shRNA构建成功。3.人肝癌HepG2细胞存活率随着微泡浓度的增加呈递减式下降,当微泡浓度小于或者等于5%时,细胞的存活率均在80%以上,当浓度达到20%时,细胞存活率下降至62%,细胞毒性明显增加,各组存活率对比具有统计学差异(P<0.05)。4.超声辐照参数摸索结果:(1)空白细胞对照组、单纯质粒组、微泡+质粒组的转染率均小于0.4%,明显低于微泡+质粒组+超声辐照组细胞的转染率,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)微泡+质粒组+超声辐照组结果提示:当微泡浓度为5%、10%时,各组转染率随着MI升高出现先增高后下降改变,差异均有统计学意义(P<0.05);当微泡浓度达到20%时,各组细胞的转染率随时间或MI的改变无明显变化,且均低于4%,差异无统计学意义(P>0.05)。当微泡浓度为5%,辐照时间20s,MI为0.37时的基因转染率最高,可达(23.33±1.47)%。5.qPCR鉴定转染目的质粒后实验组HepG2细胞的miR-181c相对表达量(0.11±0.06)较对照组(1.02±0.26)明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),提示转染目的质粒后HepG2细胞miR-181c的表达下调。6.UTMD法介导miR-181c-shRNA转染人肝癌HepG2细胞,沉默miR-181c表达后,人肝癌HepG2细胞的增殖受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),且随着培养时间延长,差异越大。实验组GO/G1期细胞(65.83±1.31)%较对照组(61.19±1.15)%增多,具有统计学差异(P<0.05),提示细胞周期受到阻滞。结论1.miR-181c异常表达与HCC的不良预后相关联、可作为HCC的独立预后因素,表明miR-181c有可能成为HCC基因治疗新的靶标。2.人肝癌HepG2细胞的存活率与微泡浓度成反比,UTMD法可促进基因转染,当微泡浓度为5%,辐照频率2.0MHz,MI0.37,辐照时间为20s时进行辐照,基因转染率最高。3.UTMD法介导miR-181c-shRNA转染人肝癌HepG2细胞,沉默miR-181c表达后,人肝癌HepG2细胞增殖受到抑制、细胞周期发生阻滞,为进一步探讨miR-181c在HCC发病机制中的潜在作用及临床意义提供了依据。