双标记法生产转基因(Human COL1A1 cDNA)山羊胚胎的研究

来源 :中国科学院兰州化学物理研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yaodanmeidan
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本论文综述了I型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景,以此得出选题的依据,系统地开展了双标记法生产转基因(Human COLIAl cDNA)山羊胚胎的研究。研究工作共分为五个部分,主要研究内容和结果如下:   1.以莎能奶山羊皮肤组织为材料进行了细胞培养,通过分离纯化建立了莎能奶山羊皮肤成纤维细胞系。发现了一种长期超低温冻存成纤维细胞的有效方法。   2.通过成纤维细胞基因转染实验,结果表明以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性(NeoT)作为双标记,可有效筛选转基因供体细胞。   3.通过实验方法的优化,人I型al原胶原的长链RNA被成功地从RNA酶含量丰富的人包皮组织中分离,以此RNA作为模板,反转录合成了人I型al原胶原cDNA基因第一条链,完成了cDNA基因的PCR扩增和在大肠杆菌扩增质粒中的克隆,并经测序证明得到了人I型al原胶原cDNA基因。   4.以pBC1质粒为基础表达质粒,以山羊B-酪蛋白基因启动子为调控元件,通过表达质粒的改造,成功构建了人I型al原胶原cDNA基因乳腺特异性表达载体,引入了具有独立表达功能的EGFP和Ned双标记筛选基因。将确认重构质粒送出测序,结果证明,表达载体内,目的基因无碱基缺失、阅读框正确、3’端连接有6xHis蛋白分离标签。   5.利用绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性(Neo)基因作为双标记基因,有效地筛选了携带大I型al原胶原cDNA基因的供体成纤维细胞,提高了携带大I型al原胶原cDNA基因核移植胚胎的生产效率。
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