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滞育是由环境中光周期或温度等因子诱导的生长发育停滞状态，许多昆虫可通过滞育在不利繁殖的季节中存活。提前感知环境变化并进行相应的生长发育是保证昆虫顺利渡过不利季节的重要前提。了解环境信号如何调控昆虫滞育可为研究昆虫季节性适应策略的分子机制提供新见解。研究表明生物钟基因可以参与短日照诱导冬季滞育发生的过程。但生物钟基因是否可以参与长日照诱导夏季滞育发生过程仍有待证实，并且光周期信号通过生物钟基因调控昆虫滞育发生的分子机制亟待探索。
大猿叶虫ColaphellusbowringiBaly为我国江西、山东、黑龙江等地带常发性十字花科蔬菜害虫，光周期和温度均可以诱导其进入生殖滞育。大猿叶虫幼虫(滞育诱导光周期敏感期)可感受环境中光周期变化并作出后期的发育决定，成虫羽化后(滞育准备期)可根据幼虫期作出的发育决定开始觅食、积累营养物质等生理生化活动。昼夜节律振荡系统可能参与光周期诱导大猿叶虫进入生殖滞育的过程。本研究以大猿叶虫修水种群为实验材料，首先筛选并克隆了大猿叶虫生物钟基因，再利用荧光定量PCR、RNAi、RNA-Seq等技术探索生物钟基因参与光周期调控大猿叶虫滞育诱导和滞育准备的分子机制，主要结论如下：
1.参与大猿叶虫滞育调控的生物钟基因筛选
将滞育品系和对光周期变化不敏感的非滞育品系均饲养在长日照条件下时，仅滞育品系可以进入成虫生殖滞育。通过比较滞育品系和非滞育品系4日龄幼虫头部中生物钟基因的24h表达模式差异，可筛选出可能参与光周期调控大猿叶虫滞育过程的生物钟基因。本研究首先成功克隆了大猿叶虫的8个生物钟基因(clock、cycle、period、timeless、cryptochrome2、double-time、shaggy和vrille)，获得了clock、timeless、cryptochrome2、double-time、shaggy和vrille的全长序列。基因结构域预测和关键结构域多序列比对分析指出，大猿叶虫各个生物钟基因均具有其对应的特征结构域，并且结构域的蛋白质序列在不同物种间呈现高度的保守性。序列blastp比对和系统进化树结果显示大猿叶虫的生物钟基因与鞘翅目赤拟谷盗Triboliumcastaneum和马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata的生物钟基因具有较高的近缘性。荧光定量PCR结果指出clock、cycle、period、timeless、cryptochrome2和vrille在滞育品系和非滞育品系之间存在明显的表达差异，表明上述生物钟基因在长日照诱导大猿叶虫进入生殖滞育过程中具有潜在功能。
2.候选生物钟基因参与光周期调控大猿叶虫滞育诱导的分子机制
非24h光周期实验显示暗期经历对大猿叶虫滞育的发生具有重要影响，因此本研究首先选择了在暗期高表达的period和其功能复合体成员timeless、cryptochrome2展开相关研究。研究结果显示，生物钟基因period、timeless和cryptochrome2在诱导滞育的长日照条件下发挥功能。在长日照条件下，对光周期敏感的3日龄幼虫在干扰cryptochrome2后只影响了滞育准备期成虫的脂类积累，对卵巢发育和入土行为均无显著性影响；干扰period和timeless可以导致至少50%的个体在长日照条件下卵巢开始发育并且不入土滞育。滞育诱导期干扰period和timeless后可导致滞育准备期成虫脂类积累显著减少，JH合成基因(HMGR2、FPPS1、JHAMT1)、JH应答基因(Kr-h1、JHE1)、卵黄原蛋白基因(Vg1、Vg2)和脂肪降解基因(TGL1)的表达量显著上调，受JH抑制的脂肪合成基因(ADH、ALDH1、FAS1、TKT2)和抗逆基因(DP1、HSP21、HSP23、HSP70、SOD)的表达量显著下调。这些结果暗示了在长日照条件下滞育诱导阶段period和timeless表达量的降低可以导致滞育准备期JH合成的上升，进而调控脂类合成、卵黄原沉积、抗逆等生理过程。通过转录组测序、差异基因分析、时间序列分析和WGCNA分析发现在不同的滞育生理阶段larvalserumprotein1αchain、glutenin、trypsinβ、ctpsynthase、histoneH3/H4-like、pyruvatekinase等基因可能参与period和timeless将滞育诱导期所感受的光周期信号逐步转化为下游JH合成信号的过程。
3.候选生物钟基因参与光周期调控大猿叶虫滞育准备的分子机制
注定滞育的昆虫在滞育准备阶段仍可以在滞育诱导条件下进行觅食、寻找庇护所等生命活动。由于滞育诱导阶段所经历的光周期信号对于滞育的发生具有决定性作用，关于滞育准备期光周期信号对于昆虫滞育准备的影响仍未见报道。本研究探索了滞育准备期光周期变化对大猿叶虫滞育准备的影响及调控机制。研究结果显示，当注定滞育的初羽化大猿叶虫雌成虫被饲养于抑制滞育的短日照条件下时，其体内甘油三酯含量和细胞内脂滴含量及脂类积累显著少于滞育准备期持续饲养在滞育诱导条件下的注定滞育雌成虫。生物钟的负调控因子period和timeless可能参与上述过程。在滞育准备期时，饲养于长日照条件下的注定滞育大猿叶虫的period和timeless表达具有明显的24h节律，并且表达量显著高于饲养于短日照条件下的注定非滞育雌成虫。向初羽化的注定滞育雌虫注射dsPer1和dsTim1可以显著抑制滞育准备期的脂类积累。period和timeless可通过促进脂类合成相关基因的表达调控滞育准备期的脂类积累。此外，由滞育准备期光周期转换引起的脂类积累下降与JH信号无关。在滞育准备期通过干扰JH受体Met中断JH信号后，这种因滞育准备期光周期转换而产生的脂类积累下降现象仍然存在。综上可知，注定滞育昆虫在滞育准备期仍具有响应光周期变化的能力，光周期信号可以通过period和timeless调控脂类合成与降解相关基因的表达进而调控滞育准备期的脂类积累过程。
本研究首先鉴定和筛选了可能参与光周期调控大猿叶虫生殖滞育过程的生物钟基因。首次明确了period和timeless在滞育诱导期和滞育准备期中均发挥了重要的作用。在滞育诱导期，period和timeless可能通过larvalserumprotein1αchain、glutenin、trypsinβ、ctpsynthase、histoneH3/H4-like、pyruvatekinase等基因将光周期信号转化为下游的JH合成信号进而调控生殖滞育的发生。在滞育准备期，注定滞育大猿叶虫可以通过光周期信号调控脂类积累，period和timeless应答光周期信号进而调节脂类合成与降解相关基因的表达，从而调控滞育准备期的脂类积累过程。研究结果为生物钟基因参与光周期调控长日照滞育型昆虫滞育提供了重要证据，为揭示光周期信号调控昆虫滞育分子机制提供了重要线索，有助于深入认识昆虫季节性适应进化的途径。
大猿叶虫ColaphellusbowringiBaly为我国江西、山东、黑龙江等地带常发性十字花科蔬菜害虫，光周期和温度均可以诱导其进入生殖滞育。大猿叶虫幼虫(滞育诱导光周期敏感期)可感受环境中光周期变化并作出后期的发育决定，成虫羽化后(滞育准备期)可根据幼虫期作出的发育决定开始觅食、积累营养物质等生理生化活动。昼夜节律振荡系统可能参与光周期诱导大猿叶虫进入生殖滞育的过程。本研究以大猿叶虫修水种群为实验材料，首先筛选并克隆了大猿叶虫生物钟基因，再利用荧光定量PCR、RNAi、RNA-Seq等技术探索生物钟基因参与光周期调控大猿叶虫滞育诱导和滞育准备的分子机制，主要结论如下：
1.参与大猿叶虫滞育调控的生物钟基因筛选
将滞育品系和对光周期变化不敏感的非滞育品系均饲养在长日照条件下时，仅滞育品系可以进入成虫生殖滞育。通过比较滞育品系和非滞育品系4日龄幼虫头部中生物钟基因的24h表达模式差异，可筛选出可能参与光周期调控大猿叶虫滞育过程的生物钟基因。本研究首先成功克隆了大猿叶虫的8个生物钟基因(clock、cycle、period、timeless、cryptochrome2、double-time、shaggy和vrille)，获得了clock、timeless、cryptochrome2、double-time、shaggy和vrille的全长序列。基因结构域预测和关键结构域多序列比对分析指出，大猿叶虫各个生物钟基因均具有其对应的特征结构域，并且结构域的蛋白质序列在不同物种间呈现高度的保守性。序列blastp比对和系统进化树结果显示大猿叶虫的生物钟基因与鞘翅目赤拟谷盗Triboliumcastaneum和马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata的生物钟基因具有较高的近缘性。荧光定量PCR结果指出clock、cycle、period、timeless、cryptochrome2和vrille在滞育品系和非滞育品系之间存在明显的表达差异，表明上述生物钟基因在长日照诱导大猿叶虫进入生殖滞育过程中具有潜在功能。
2.候选生物钟基因参与光周期调控大猿叶虫滞育诱导的分子机制
非24h光周期实验显示暗期经历对大猿叶虫滞育的发生具有重要影响，因此本研究首先选择了在暗期高表达的period和其功能复合体成员timeless、cryptochrome2展开相关研究。研究结果显示，生物钟基因period、timeless和cryptochrome2在诱导滞育的长日照条件下发挥功能。在长日照条件下，对光周期敏感的3日龄幼虫在干扰cryptochrome2后只影响了滞育准备期成虫的脂类积累，对卵巢发育和入土行为均无显著性影响；干扰period和timeless可以导致至少50%的个体在长日照条件下卵巢开始发育并且不入土滞育。滞育诱导期干扰period和timeless后可导致滞育准备期成虫脂类积累显著减少，JH合成基因(HMGR2、FPPS1、JHAMT1)、JH应答基因(Kr-h1、JHE1)、卵黄原蛋白基因(Vg1、Vg2)和脂肪降解基因(TGL1)的表达量显著上调，受JH抑制的脂肪合成基因(ADH、ALDH1、FAS1、TKT2)和抗逆基因(DP1、HSP21、HSP23、HSP70、SOD)的表达量显著下调。这些结果暗示了在长日照条件下滞育诱导阶段period和timeless表达量的降低可以导致滞育准备期JH合成的上升，进而调控脂类合成、卵黄原沉积、抗逆等生理过程。通过转录组测序、差异基因分析、时间序列分析和WGCNA分析发现在不同的滞育生理阶段larvalserumprotein1αchain、glutenin、trypsinβ、ctpsynthase、histoneH3/H4-like、pyruvatekinase等基因可能参与period和timeless将滞育诱导期所感受的光周期信号逐步转化为下游JH合成信号的过程。
3.候选生物钟基因参与光周期调控大猿叶虫滞育准备的分子机制
注定滞育的昆虫在滞育准备阶段仍可以在滞育诱导条件下进行觅食、寻找庇护所等生命活动。由于滞育诱导阶段所经历的光周期信号对于滞育的发生具有决定性作用，关于滞育准备期光周期信号对于昆虫滞育准备的影响仍未见报道。本研究探索了滞育准备期光周期变化对大猿叶虫滞育准备的影响及调控机制。研究结果显示，当注定滞育的初羽化大猿叶虫雌成虫被饲养于抑制滞育的短日照条件下时，其体内甘油三酯含量和细胞内脂滴含量及脂类积累显著少于滞育准备期持续饲养在滞育诱导条件下的注定滞育雌成虫。生物钟的负调控因子period和timeless可能参与上述过程。在滞育准备期时，饲养于长日照条件下的注定滞育大猿叶虫的period和timeless表达具有明显的24h节律，并且表达量显著高于饲养于短日照条件下的注定非滞育雌成虫。向初羽化的注定滞育雌虫注射dsPer1和dsTim1可以显著抑制滞育准备期的脂类积累。period和timeless可通过促进脂类合成相关基因的表达调控滞育准备期的脂类积累。此外，由滞育准备期光周期转换引起的脂类积累下降与JH信号无关。在滞育准备期通过干扰JH受体Met中断JH信号后，这种因滞育准备期光周期转换而产生的脂类积累下降现象仍然存在。综上可知，注定滞育昆虫在滞育准备期仍具有响应光周期变化的能力，光周期信号可以通过period和timeless调控脂类合成与降解相关基因的表达进而调控滞育准备期的脂类积累过程。
本研究首先鉴定和筛选了可能参与光周期调控大猿叶虫生殖滞育过程的生物钟基因。首次明确了period和timeless在滞育诱导期和滞育准备期中均发挥了重要的作用。在滞育诱导期，period和timeless可能通过larvalserumprotein1αchain、glutenin、trypsinβ、ctpsynthase、histoneH3/H4-like、pyruvatekinase等基因将光周期信号转化为下游的JH合成信号进而调控生殖滞育的发生。在滞育准备期，注定滞育大猿叶虫可以通过光周期信号调控脂类积累，period和timeless应答光周期信号进而调节脂类合成与降解相关基因的表达，从而调控滞育准备期的脂类积累过程。研究结果为生物钟基因参与光周期调控长日照滞育型昆虫滞育提供了重要证据，为揭示光周期信号调控昆虫滞育分子机制提供了重要线索，有助于深入认识昆虫季节性适应进化的途径。