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CRISPR/Cas9技术是一种由sgRNA和Cas9蛋白介导的，特异性切割dsDNA并引起基因突变的基因编辑系统。该技术具有普适性、高特异性、高效性等特点，已经广泛地应用于医学、生物学、农业等多个领域中。在昆虫中，基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术也得到了快速的发展，主要用于昆虫基因组学基础研究与害虫的防控。橘小实蝇是国内重要的农业害虫，每年给果蔬产业带来巨大的经济损失，防治困难，利用现代生物技术研发新型环境友好型防治技术是未来的方向。本研究以橘小实蝇为研究材料，建立了快速高效的基因编辑体系；构建了适用于橘小实蝇基因编辑的载体，并筛选出橘小实蝇基因敲除的最优方案；通过单胚胎测序揭示了橘小实蝇胚胎时期性别分化的关键通路并筛选鉴定了Y染色体特异基因；利用CRISPR/Cas9技术研究阐明了Y特异性基因spermless在精子发生以及精巢发育中的关键作用，为未来橘小实蝇遗传改造和防治提供靶标基因。
1.利用CRISPR/Cas9成功实现了橘小实蝇的靶标基因multipleedematouswings(mew)的敲除。成功克隆获得橘小实蝇mew基因mRNA，全长4051bp，编码1168个氨基酸；蛋白序列分析发现包含四个Integrin-α结构域和一个Integrin-α2结构域；时空表达模式表明该基因主要在胸部与蛹期高表达；通过体外合成并筛选出活性最高的sgRNA用于mew基因敲除；在G0中，未发现与对照组有明显差异的表型，但是通过RED方法检测到了基因突变，突变率达到12.1%-30.2%；通过G0异型杂交，在G1获得了73.8%的突变个体，包括有20%的个体不能正常羽化，53.8%的个体不能正常飞行。在成功羽化且不能飞行的个体中，翅出现了明显褶皱，不能正常伸展的现象，长度只有野生型的75%左右。在G1中，由于突变表型严重影响其正常的取食、繁殖等行为，导致没有产生G2。在突变体胸部肌肉组织肌节之间，富集了很多脂肪滴，线粒体的体积有明显的减少，并且肌肉处于松弛状态。基因型检测发现主要有三种类型的突变，两个碱基缺失突变和一个综合型，包括碱基的删除、插入与替换；脱靶检测没有发现脱靶突变，说明CRISPR/Cas9技术在橘小实蝇中能成功实现较高效特异的基因编辑。
2.构建了适用于橘小实蝇的快速敲除质粒，并通过比较筛选优化了橘小实蝇基因敲除技术。克隆获得橘小实蝇的两个U6启动子，bdU6.1和bdU6.2，可以用于包括sgRNA在内的非编码RNA的内源性表达；证明了PUB启动子在橘小实蝇胚胎中具有很高的活性，可以用于启动其下游基因的表达；成功构建了all-in-one质粒，能够同时表达sgRNA和Cas9，从而实现一体化表达并敲除靶标基因的功能；通过体外合成并筛选出活性最高的sgRNA，可用于tra基因的敲除；使用all-in-one质粒成功敲除tra基因，在G0中嵌合比例为43.75%；突变tra之后，导致雌性生殖系统发育障碍，卵巢附腺色素沉积；比较了Cas9质粒/sgRNA、Cas9蛋白/sgRNA、Cas9mRNA/sgRNA和Cas9/sgRNA质粒四种导入方法在橘小实蝇基因敲除中的效率，发现Cas9蛋白/sgRNA混合注射的效率最高。
3.通过早期单胚胎测序并进行有参转录组分析，筛选获得了在胚胎性别分化时期雌雄差异性转录本数据库，在此数据库中有共1613个差异表达基因(|log2(foldchange)|≥1，p<0.05)，其中雄性高表达基因有1395个，而雌性高表达基因只有218个。对雌雄表达差异基因进行GO功能聚类分析，结果显示主要聚类到生物过程中的有神经形成、卵子发生、剪接体途径的mRNA剪接等过程；而聚类到细胞组分中的主要是细胞核和细胞质；聚类到分子功能上的有蛋白结合、DNA结合、mRNA结合。聚类结果表明雌雄胚胎差异基因主要聚类在细胞复制与分化中，尤其是与核酸相关的通路中，比如DNA结合、mRNA结合、mRNA剪接等。说明在早期胚胎中，雌雄胚胎在基因表达调控就已经分化。分化主要体现在胚胎神经系统的形成和mRNA的转录与剪接方面。这个结果指导我们进行性别分化研究时要偏向于神经系统的形成与mRNA的剪接方面。KEGGpathway聚类主要聚类在RNA转运、剪接体、mRNA监测途径、RNA降解等。这个结果表明在雌雄性别决定过程中mRNA的多种通路起到了关键的作用，从mRNA的剪接、监管到mRNA的转运以及降解都有涉及。在橘小实蝇早期胚胎中有35个已知的性别决定相关基因有表达，其中有8个基因在雌雄胚胎中表达量有显著性差异，并且全都是雄性特异性表达；对雄性胚胎转录进行了从头组装，通过CQ方法筛选出189个可能位于Y染色体的片段，最终通过PCR验证获得了4个Y特异性基因。
4.利用CRISPR/Cas9技术研究阐明了Y特异性基因spermless在精巢及精子发生中的关键作用。克隆获得Y染色体特异性基因spermless，全长1056bp，编码91个氨基酸，该基因是一个不含任何内含子序列的全外显子基因；蛋白序列分析结果显示spermless含有三个跨膜结构域，在N’端含有一个信号肽，主要定位于细胞膜与质膜；时空表达模式分析结果表明spermless主要在产卵后胚胎5-6h高表达，并且在精巢中特异性表达，随着精巢的发育表达量递增；利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了spermless基因，突变效率为53.85%，没有发生性别逆转现象，但是G0不育，并且精巢发育障碍，性梳发育混乱；对胚胎进行spermless的RNA干扰，同样导致其不育，并且精巢发育障碍，白化现象，雄性性梳完全消失；对初羽化雄虫进行spermless的RNA干扰，结果发现其精巢发育明显迟缓，并且精子活性显著降低，精子数量减少。这些结果说明spermless基因在橘小实蝇精巢发育及精子发生中的重要作用。
1.利用CRISPR/Cas9成功实现了橘小实蝇的靶标基因multipleedematouswings(mew)的敲除。成功克隆获得橘小实蝇mew基因mRNA，全长4051bp，编码1168个氨基酸；蛋白序列分析发现包含四个Integrin-α结构域和一个Integrin-α2结构域；时空表达模式表明该基因主要在胸部与蛹期高表达；通过体外合成并筛选出活性最高的sgRNA用于mew基因敲除；在G0中，未发现与对照组有明显差异的表型，但是通过RED方法检测到了基因突变，突变率达到12.1%-30.2%；通过G0异型杂交，在G1获得了73.8%的突变个体，包括有20%的个体不能正常羽化，53.8%的个体不能正常飞行。在成功羽化且不能飞行的个体中，翅出现了明显褶皱，不能正常伸展的现象，长度只有野生型的75%左右。在G1中，由于突变表型严重影响其正常的取食、繁殖等行为，导致没有产生G2。在突变体胸部肌肉组织肌节之间，富集了很多脂肪滴，线粒体的体积有明显的减少，并且肌肉处于松弛状态。基因型检测发现主要有三种类型的突变，两个碱基缺失突变和一个综合型，包括碱基的删除、插入与替换；脱靶检测没有发现脱靶突变，说明CRISPR/Cas9技术在橘小实蝇中能成功实现较高效特异的基因编辑。
2.构建了适用于橘小实蝇的快速敲除质粒，并通过比较筛选优化了橘小实蝇基因敲除技术。克隆获得橘小实蝇的两个U6启动子，bdU6.1和bdU6.2，可以用于包括sgRNA在内的非编码RNA的内源性表达；证明了PUB启动子在橘小实蝇胚胎中具有很高的活性，可以用于启动其下游基因的表达；成功构建了all-in-one质粒，能够同时表达sgRNA和Cas9，从而实现一体化表达并敲除靶标基因的功能；通过体外合成并筛选出活性最高的sgRNA，可用于tra基因的敲除；使用all-in-one质粒成功敲除tra基因，在G0中嵌合比例为43.75%；突变tra之后，导致雌性生殖系统发育障碍，卵巢附腺色素沉积；比较了Cas9质粒/sgRNA、Cas9蛋白/sgRNA、Cas9mRNA/sgRNA和Cas9/sgRNA质粒四种导入方法在橘小实蝇基因敲除中的效率，发现Cas9蛋白/sgRNA混合注射的效率最高。
3.通过早期单胚胎测序并进行有参转录组分析，筛选获得了在胚胎性别分化时期雌雄差异性转录本数据库，在此数据库中有共1613个差异表达基因(|log2(foldchange)|≥1，p<0.05)，其中雄性高表达基因有1395个，而雌性高表达基因只有218个。对雌雄表达差异基因进行GO功能聚类分析，结果显示主要聚类到生物过程中的有神经形成、卵子发生、剪接体途径的mRNA剪接等过程；而聚类到细胞组分中的主要是细胞核和细胞质；聚类到分子功能上的有蛋白结合、DNA结合、mRNA结合。聚类结果表明雌雄胚胎差异基因主要聚类在细胞复制与分化中，尤其是与核酸相关的通路中，比如DNA结合、mRNA结合、mRNA剪接等。说明在早期胚胎中，雌雄胚胎在基因表达调控就已经分化。分化主要体现在胚胎神经系统的形成和mRNA的转录与剪接方面。这个结果指导我们进行性别分化研究时要偏向于神经系统的形成与mRNA的剪接方面。KEGGpathway聚类主要聚类在RNA转运、剪接体、mRNA监测途径、RNA降解等。这个结果表明在雌雄性别决定过程中mRNA的多种通路起到了关键的作用，从mRNA的剪接、监管到mRNA的转运以及降解都有涉及。在橘小实蝇早期胚胎中有35个已知的性别决定相关基因有表达，其中有8个基因在雌雄胚胎中表达量有显著性差异，并且全都是雄性特异性表达；对雄性胚胎转录进行了从头组装，通过CQ方法筛选出189个可能位于Y染色体的片段，最终通过PCR验证获得了4个Y特异性基因。
4.利用CRISPR/Cas9技术研究阐明了Y特异性基因spermless在精巢及精子发生中的关键作用。克隆获得Y染色体特异性基因spermless，全长1056bp，编码91个氨基酸，该基因是一个不含任何内含子序列的全外显子基因；蛋白序列分析结果显示spermless含有三个跨膜结构域，在N’端含有一个信号肽，主要定位于细胞膜与质膜；时空表达模式分析结果表明spermless主要在产卵后胚胎5-6h高表达，并且在精巢中特异性表达，随着精巢的发育表达量递增；利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了spermless基因，突变效率为53.85%，没有发生性别逆转现象，但是G0不育，并且精巢发育障碍，性梳发育混乱；对胚胎进行spermless的RNA干扰，同样导致其不育，并且精巢发育障碍，白化现象，雄性性梳完全消失；对初羽化雄虫进行spermless的RNA干扰，结果发现其精巢发育明显迟缓，并且精子活性显著降低，精子数量减少。这些结果说明spermless基因在橘小实蝇精巢发育及精子发生中的重要作用。