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背景及目的：
血-脊髓屏障（blood-spinalcordbarrier，BSCB）由血管内皮细胞、星形胶质细胞尾足和周细胞组成，介导血液和脊髓之间的分子交换以保持正常的功能和信息处理的屏障系统。脊髓损伤（spinalcordinjury，SCI）后常常导致血脊屏障的破坏，在损伤瞬间机械破坏毛细血管后，血液中的分子和细胞很容易进入受伤的实质，在病理生理学上进一步导致脊髓损伤以及血脊屏障的功能障碍。硫化氢（Hydrogensulfide，H2S）是一种普遍存在的小气体信号分子，在许多生理过程中起着重要的作用，但其对于脊髓损伤后血脊屏障的作用还未见报道。作为气体信号传导分子，硫化氢能够以不依赖受体的方式自由地跨越细胞膜扩散并激活各种细胞靶标。本项目基于硫化氢这种独特的能力，外源性给予NaHS（H2S供体），通过动物和细胞实验，全面探讨其对脊髓损伤后血脊屏障的修复作用及机制，旨在为临床治疗脊髓损伤提供新思路并使硫化氢有可能成为治疗脊髓损伤的药物制剂。
方法：
采用动脉血管夹(30g，1min)压迫脊髓的方法来制作大鼠脊髓损伤的动物模型以及运用糖氧剥夺（Oxygen-glucosedeprivation，OGD）的方法在细胞上模拟脊髓损伤模型。通过westernblot检测大鼠脊髓损伤模型6小时，12小时，1天，3天及7天后连接蛋白（Occludin、P120和β-catenin），自噬相关蛋白（Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ）和内质网应激相关蛋白（GRP78、PDI）指标探讨损伤后随不同时间点血脊屏障的破坏情况及潜在机制。将36只动物模型随机分为假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组)、H2S治疗组(SCI+NaHS组)。给药组每只SD大鼠按体重腹腔注射5.6mg/kg的NaHS溶液，模型组腹腔注射同等量的PBS。采用伊文思蓝渗透法研究H2S是否能降低脊髓损伤后BSCB的渗透量，免疫荧光染色、westernblot等技术在动物及细胞模型上研究检测H2S是否能保护脊髓损伤后BSCB的完整性以及参与其中的分子机制。采用TUNEL染色以及Bcl-2、Bax蛋白表达情况分析H2S是否能减少损伤后神经元的凋亡。采用BBB法对各时间点大鼠模型后肢运动功能进行评分。随后使用内质网应激抑制剂4-PBA、激活剂TM以及自噬抑制剂3-MA、激活剂Rapa，通过westernblot和免疫荧光分析内质网应激和自噬相关蛋白进一步探讨H2S参与脊髓损伤后血脊屏障保护作用的机制。
结果：
(1)Westernblot发现，在脊髓损伤急性期，内质网应激及自噬显著激活。SCI组内质网应激相关蛋白（GRP78、PDI、caspase-12、CHOP、P-JNK、ATF6）及自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、ATG7）比Sham组显著增加，而H2S治疗组对比SCI组内质网应激和自噬相关蛋白的表达下调，同时损伤后mTOR的蛋白磷酸化水平显著降低，而与SCI组相比，H2S治疗组mTOR的蛋白磷酸化水平则上升。为进一步探讨SCI后自噬和内质网应激的上下游关系，通过给予自噬抑制剂3-MA及内质网应激抑制剂4-PBA分别处理损伤后模型发现，4-PBA抑制内质网应激后自噬也被抑制，而3-MA抑制自噬后内质网应激表达无明显变化。细胞实验也显示H2S能抑制OGD处理过的HUVEC细胞内质网应激和自噬的激活。
(2)SCI后急性期BSCB受到了破坏，在夹闭损伤周围伊文思蓝渗出增加，提前半小时给予5.6mg/kgNaHS后造模可显著减少伊文思蓝的渗透量。Westernblot及免疫荧光染色表明H2S明显抑制了紧密连接蛋白（Occludin）和粘附蛋白（P120，β-catenin）的表达下降，这证实H2S能维持SCI后BSCB的完整性。细胞实验也显示H2S能抑制OGD处理过的HUVEC细胞间粘附蛋白和连接蛋白表达下降。此外，用内质网应激激活剂TM及自噬激活剂Rapa分别共处理H2S治疗组后消除了H2S对BSCB的保护作用。BBB评分也显示H2S治疗组明显高于SCI组，而TM和Rapa处理后显著抑制的H2S治疗作用。
(3)神经元凋亡是脊髓损伤后的严重继发性损伤之一，TUNEL染色的结果显示，大鼠损伤处周围的TUNEL阳性细胞在损伤后对比Sham组显著增加，而H2S治疗组对比SCI组的凋亡细胞数量明显减少。通过Westernbolt发现，SCI组Bcl-2表达量较Sham组明显降低，Bax表达量则明显升高，而H2S治疗后改善了这一现象。
结论：
H2S能促进BSCB的修复、减少神经元的凋亡从而具有促进SD大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。H2S对血脊屏障的保护作用是通过抑制内质网应激和自噬达到的，并且在脊髓损伤后内质网应激处于自噬的上游。我们的研究结果提供了H2S可以通过保护脊髓损伤后血脊屏障保护的全新治疗思路。
血-脊髓屏障（blood-spinalcordbarrier，BSCB）由血管内皮细胞、星形胶质细胞尾足和周细胞组成，介导血液和脊髓之间的分子交换以保持正常的功能和信息处理的屏障系统。脊髓损伤（spinalcordinjury，SCI）后常常导致血脊屏障的破坏，在损伤瞬间机械破坏毛细血管后，血液中的分子和细胞很容易进入受伤的实质，在病理生理学上进一步导致脊髓损伤以及血脊屏障的功能障碍。硫化氢（Hydrogensulfide，H2S）是一种普遍存在的小气体信号分子，在许多生理过程中起着重要的作用，但其对于脊髓损伤后血脊屏障的作用还未见报道。作为气体信号传导分子，硫化氢能够以不依赖受体的方式自由地跨越细胞膜扩散并激活各种细胞靶标。本项目基于硫化氢这种独特的能力，外源性给予NaHS（H2S供体），通过动物和细胞实验，全面探讨其对脊髓损伤后血脊屏障的修复作用及机制，旨在为临床治疗脊髓损伤提供新思路并使硫化氢有可能成为治疗脊髓损伤的药物制剂。
方法：
采用动脉血管夹(30g，1min)压迫脊髓的方法来制作大鼠脊髓损伤的动物模型以及运用糖氧剥夺（Oxygen-glucosedeprivation，OGD）的方法在细胞上模拟脊髓损伤模型。通过westernblot检测大鼠脊髓损伤模型6小时，12小时，1天，3天及7天后连接蛋白（Occludin、P120和β-catenin），自噬相关蛋白（Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ）和内质网应激相关蛋白（GRP78、PDI）指标探讨损伤后随不同时间点血脊屏障的破坏情况及潜在机制。将36只动物模型随机分为假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组)、H2S治疗组(SCI+NaHS组)。给药组每只SD大鼠按体重腹腔注射5.6mg/kg的NaHS溶液，模型组腹腔注射同等量的PBS。采用伊文思蓝渗透法研究H2S是否能降低脊髓损伤后BSCB的渗透量，免疫荧光染色、westernblot等技术在动物及细胞模型上研究检测H2S是否能保护脊髓损伤后BSCB的完整性以及参与其中的分子机制。采用TUNEL染色以及Bcl-2、Bax蛋白表达情况分析H2S是否能减少损伤后神经元的凋亡。采用BBB法对各时间点大鼠模型后肢运动功能进行评分。随后使用内质网应激抑制剂4-PBA、激活剂TM以及自噬抑制剂3-MA、激活剂Rapa，通过westernblot和免疫荧光分析内质网应激和自噬相关蛋白进一步探讨H2S参与脊髓损伤后血脊屏障保护作用的机制。
结果：
(1)Westernblot发现，在脊髓损伤急性期，内质网应激及自噬显著激活。SCI组内质网应激相关蛋白（GRP78、PDI、caspase-12、CHOP、P-JNK、ATF6）及自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、ATG7）比Sham组显著增加，而H2S治疗组对比SCI组内质网应激和自噬相关蛋白的表达下调，同时损伤后mTOR的蛋白磷酸化水平显著降低，而与SCI组相比，H2S治疗组mTOR的蛋白磷酸化水平则上升。为进一步探讨SCI后自噬和内质网应激的上下游关系，通过给予自噬抑制剂3-MA及内质网应激抑制剂4-PBA分别处理损伤后模型发现，4-PBA抑制内质网应激后自噬也被抑制，而3-MA抑制自噬后内质网应激表达无明显变化。细胞实验也显示H2S能抑制OGD处理过的HUVEC细胞内质网应激和自噬的激活。
(2)SCI后急性期BSCB受到了破坏，在夹闭损伤周围伊文思蓝渗出增加，提前半小时给予5.6mg/kgNaHS后造模可显著减少伊文思蓝的渗透量。Westernblot及免疫荧光染色表明H2S明显抑制了紧密连接蛋白（Occludin）和粘附蛋白（P120，β-catenin）的表达下降，这证实H2S能维持SCI后BSCB的完整性。细胞实验也显示H2S能抑制OGD处理过的HUVEC细胞间粘附蛋白和连接蛋白表达下降。此外，用内质网应激激活剂TM及自噬激活剂Rapa分别共处理H2S治疗组后消除了H2S对BSCB的保护作用。BBB评分也显示H2S治疗组明显高于SCI组，而TM和Rapa处理后显著抑制的H2S治疗作用。
(3)神经元凋亡是脊髓损伤后的严重继发性损伤之一，TUNEL染色的结果显示，大鼠损伤处周围的TUNEL阳性细胞在损伤后对比Sham组显著增加，而H2S治疗组对比SCI组的凋亡细胞数量明显减少。通过Westernbolt发现，SCI组Bcl-2表达量较Sham组明显降低，Bax表达量则明显升高，而H2S治疗后改善了这一现象。
结论：
H2S能促进BSCB的修复、减少神经元的凋亡从而具有促进SD大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。H2S对血脊屏障的保护作用是通过抑制内质网应激和自噬达到的，并且在脊髓损伤后内质网应激处于自噬的上游。我们的研究结果提供了H2S可以通过保护脊髓损伤后血脊屏障保护的全新治疗思路。