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水稻籽粒灌浆是籽粒发育的重要过程,直接影响籽粒的结实率与粒重,最终影响水稻的产量与品质。有研究表明,生长素IAA与水稻光合产物分配过程密切相关,是光合产物分配过程中许多限速和限量因子的调节剂。水稻源(叶片)和库(穗子)组织中都含有一定浓度的IAA,特别是发育中的籽粒,其IAA含量要比其它组织高得多。籽粒中的IAA含量动态变化与籽粒灌浆速率表现基本一致。有研究结果表明,内源或外源生长素IAA能促进水稻籽粒灌浆、叶光合作用效率及其产物分配,从而提高水稻结实率和产量。YUCCA基因是生长素IAA生物合成途径中的限速酶基因,YUCCA基因过表达能显著性地促进IAA的生物合成。本研究利用水稻和拟南芥YUCCA基因和一些组织特异性表达的启动子,通过分子生物学方法和转基因手段提高水稻叶片、籽粒中的内源生长素IAA的生物合成效率,以促进水稻光合作用效率与籽粒发育,从而提高水稻产量或品质。主要研究结果如下:
1.以不同浓度的外源生长素2,4-D分别处理水稻日本晴(Oryza sativaL.spp.japonica cv.Nipponbare)幼穗和剑叶,统计分析其结实率和千粒重。用50、100μM2,4-D处理幼穗能显著性地促进水稻结实率和千粒重(P<0.05,t-test)。用相同浓度的2,4-D处理水稻剑叶,未能有效地促进水稻结实率,但100、200μM2,4-D能显著性地提高千粒重。这些研究结果表明,外源生长素对特异性组织处理能有效地促进水稻结实率和千粒重。
2.采用Real-time PCR技术分别检测14个OsYUCCA同源基因在水稻籽粒灌浆(开花后0、5、10、15和20天)过程中的表达模式。结果发现7个OsYUCCA(1、2、3、7、8、9和11)基因的表达上调,4个Os YUCCA(4、5、6、10)基因的表达下调,其余3个基因(Os YUCCA12、13和14)在籽粒灌浆过程中无表达。这些结果暗示,YUCCA介导的生长素生物合成途径参与水稻籽粒灌浆。
3.利用RT-PCR技术从水稻、拟南芥中分别克隆OsYUCCA2和AtYUCCA1的编码序列CDS;同时,从水稻、拟南芥和棉花基因组中分别克隆水稻胚乳特异性启动子OsGt1和OsGluB、拟南芥叶片特异性启动子Atrbcs、棉花种皮特异性启动子GhSCFP。然后,通过酶切、连接和测序等方法,将YUCCA基因分别与这些组织特异性表达的启动子融合,再构建到含GUS的表达载体上,共成功构建6个YUCCA表达载体,包括4个胚乳特异性表达载体(OsGt1::OsYUCCA2:GUS、 OsGt1::AtYUCCA1:GU、OsGluB:: OsYUCCA2:GUS、OsGluB::AtYUCCA1:GUS)、1个叶组织特异性表达载体(Atrbcs::OsYUCCA2: GUS)和1个种皮特异性表达载体(GhSCFP::OsYUCCA2:GUS)。
4.通过农杆菌介导法,将上述6个表达载体分别导入水稻日本晴愈伤组织中,获得再生植株。通过PCR鉴定,各表达载体均获得一定数量的T1代转基因植株。RT-PCR和/或GUS染色结果表明,在OsGt1::YUCCA:GUS或OsGluB::YUCCA:GUS的转基因植株中,YUCCA:GUS在籽粒胚乳中特异性表达;在Atrbcs::OsYUCCA2:GUS转基因植株中,YUCCA:GUS在叶组织、花药和根中均有表达;在GhSCFP:: OsYUCCA2:GUS转基因植株中,YUCCA:GUS在籽粒种皮中只有微弱的表达,但在花药中却有较强的表达,表明棉花种皮特异性启动子GhSCFP在水稻中的表达活性发生了改变。
5.通过抗性筛选(G418),获得YUCCA:GUS胚乳特异性表达的T3代纯合体,并对T3纯合体株系的结实率、千粒重以及单株产量进行了统计。结果表明,在OsGluB::AtYUCCA1:GUS和OsGt1:AtYUCCA1:GUS转基因株系中各发现2个高结实率的转基因株系,而在OsGluB::OsYUCCA2:GUS和OsGt1::OsYUCCA2: GUS转基因株系中没有发现高结实率的株系,这可能由于不同转基因株系太少;千粒重统计分析表明,这4个胚乳特异性表达载体的转基因株系的千粒重与对照相比均没有明显差异。然而,单株产量统计分析表明,除OsGluB::OsYUCCA2:GUS转基因株系外,其余三个表达载体的转基因株系中均发现单株产量与对照相比有显著性差异的高产株系(P<0.05)。另外,由于Atrbcs::OsYUCCA2:GUS和GhSCFP:: OsYUCCA2:GUS的转基因T3纯合株系还未鉴定,其结实率、千粒重和单株产量将在后续研究中进行。