共表达盐生隐杆藻甘氨酸甲基化酶基因ApGSMT和ApDMT提高水稻抗逆性研究

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甘氨酸甜菜碱(Glycinebetaine,GB),简称甜菜碱,是一种重要的相容性物质,作为渗透调节保护剂广泛存在于微生物、动物和植物中。在植物应对非生物胁迫(如高盐,低温、干旱等)过程中,起到重要的保护作用,作为渗透调节剂,它能够维持细胞的渗透平衡;同时作为渗透保护剂稳定各种酶和蛋白复合物的四级结构以及降低膜脂的过氧化等。甜菜碱的合成途径,根据合成的起始底物的不同,大致分为胆碱氧化/还原途径和甘氨酸甲基化途径。不同于胆碱氧化/还原途径,甘氨酸甲基化途径是以甘氨酸为起始底物,通过两个甲基转移酶(甘氨酸肌氨酸甲基转移酶和肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶),逐步的甲基化甘氨酸生成甜菜碱。   水稻是一种重要的粮食作物,但它不能合成和积累甜菜碱来应对非生物胁迫,属于甜菜碱的非自然积累者。在本研究中,我们通过农杆菌介导的遗传转化方法,将来自嗜盐微生物盐生隐杆藻编码甲基转移酶的两个基因(ApGSMT和ApDMT),共同转入水稻中。获得了这两个基因共表达的水稻转基因植株,对转基因植株的表达、产物合成情况和抗非生物胁迫能力分析得到以下结果:   ①通过半定量PCR(semi RT-PCR)和定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析了ApGSMT和ApDMT在不同植株叶片及不同组织中的表达情况。结果显示在所分析的6个转基因水稻植株叶片中,这两基因都能够得到表达,虽然在表达水平上有所差异。组织表达模式分析显示,ApGSMT和ApDMT在水稻的组织(根、茎、叶、叶鞘和花)中也都有表达。相对于表达水平,甜菜碱作为这两个酶的终产物,HPLC测定结果显示,在所测定的成熟叶片和不同组织中,甜菜碱都有合成和积累。在作为对照的野生型中,ApGSMT和ApDMT的表达,及终产物甜菜碱都没有被检测到。   ②通过叶片在盐胁迫条件下的衰老实验,我们观察到甜菜碱的积累能够降低叶片叶绿素的破坏程度,从而保护水稻叶绿体的完整性。盐胁迫条件下的萌发实验显示,甜菜碱的积累能够提高种子的萌发率,减轻盐胁迫对幼苗的生长抑制;且甜菜碱的积累水平随胁迫强度的增加而增加。通过种子在盐溶液中萌发后幼苗解除胁迫恢复生长实验,转基因幼苗在苗高、根长和生物量有明显的恢复的生长,证明了甜菜碱的积累能够减轻盐胁迫对幼苗的生长抑制,提高自身的存活和生长。   ③低温环境胁迫实验证实了这两个酶基因的表达对于提高转基因水稻抗低温能力的潜在作用。水稻幼苗或生长期植株经低温处理后恢复生长实验结果显示,甜菜碱的积累,能够减轻叶片在低温环境的受损程度。转基因幼苗或植株经低温处理后,其生长能够快速的得到恢复。   这些结果表明了在水稻中的共表达甲基转移酶基因ApGSMT和ApDMT,能够使水稻合成和积累甜菜碱应对非生物胁迫,且甜菜碱的积累提高了水稻的抗盐和抗低温胁迫的能力。表明了甲基转移酶编码基因在提高作物抗性基因工程上的潜在应用价值。
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