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本文为了了解恩诺沙星在环境中残留对土壤微生物的影响，采用HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相色谱)分析法对猪场及其周围环境进行了恩诺沙星的残留检测；采用琼脂稀释法对土壤细菌进行了抗菌药物敏感性试验；应甩ARDRA(amplifled ribosomal DNA restriction analysis，扩增核糖体DNA限制性分析)对土壤细菌16s rDNA序列多样性进行了研究，并结合ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence，ERIC肠杆菌基因间的重复共有序列；polymerase chain reaction，PCR聚合酶链式反应)指纹图谱分析了恩诺沙星对土壤细菌种群遗传多样性的影响；通过PCR扩增、基因克隆、RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)分析法对恩诺沙星影响下的土壤微生物固氮酶nifH基因和反硝化酶nosZ基因的分子多样性进行了分析；采用BIOLOG方法比较了不同浓度恩诺沙星对土壤微生物群落功能多样性的影响。本文比较系统地研究了恩诺沙星对土壤微生物耐药性、分子多样性及群落功能多样性的影响，以便对恩诺沙星的环境安全作出评价。主要研究结论如下：
1、猪场与周围环境中恩诺沙星残留的检测。给猪饲喂含恩诺沙星(200g/t)的饲料后，采甩HPLC分析法对猪场及其周围环境进行了药物残留检测。猪粪便中的药物浓度明显高于尿液中的药物浓度，粪便中恩诺沙星的排泄量高于其代谢产物环丙沙星的量，尿液中环丙沙星的浓度高于恩诺沙星的浓度；粪便中恩诺沙星和环丙沙星的最高含量分别为132.35±39.59μg/g、5.72±1.25μg/g；尿液中恩诺沙星和环丙沙星的最高含量分别为3.54±3.00μg/mL、13.43±8.60μg/mL；发酵池内粪渣中恩诺沙星及环丙沙星的最高含量分别为10.83μg/g和5.25μg/g，粪水中恩诺沙星和环丙沙星最高含量分别为352.8ng/mL和169.2ng/mL；土壤中恩诺沙星和环丙沙星最高含量分别为140.7ng/g和75.6ng/g；排污沟污水和池塘水中的药物含量相对较低。停止用药后第30d在猪场周围环境中仍可检测到恩诺沙星。
2、恩诺沙星残留对土壤细菌耐药性的影响。在土壤中加入恩诺沙星使药物含量分别为，Ⅰ组Oug/g、Ⅱ组0.01μg/g、Ⅲ组0.1μg/g、Ⅳ组1μg/g、Ⅴ组10μg/g、Ⅵ组50μg/g。采用琼脂稀释法对用药前和用药后分离的土壤优势细菌进行了药物敏感性试验，结果表明，恩诺沙星对用药前分离的优势细菌的MIC(minimum inhibitory concentration，最小抑菌浓度)比较低，为0.008～2μg/mL，其中对大多数分离细菌的MIC为0.032～0.125μg/mL；用药后分离的细菌对恩诺沙星的敏感性降低，细菌对恩诺沙星的耐药率和耐药水平随土壤中药物浓度的加大和药物作用时间的延长而明显增高。在供试的19种抗菌药中，恩诺沙星敏感菌对其中的16种药物的敏感性都显著高于恩诺沙星耐药菌(P<0.01)。恩诺沙星对土壤细菌最低选择浓度(minimum selectedconcentration，MSC)为4μg/g。
3、恩诺沙星残留对土壤细菌DNA序列多样性的影响。在恩诺沙星作用于土壤后第35d，对纯培养法分离的土壤细菌进行了计数，并采用ARDRA方法对分离菌株16S rDNA的PCR扩增产物进行了多态性分析，然后对各组优势种群的细菌进行了ERIC-PCR指纹图谱分析。结果表明，添加药物组的细菌总数均低于空白对照组，且药物浓度越高，细菌数量越少；ARDRA分析将各组分离的土壤细菌分成了不同的OTU(operational taxonomic unit，可操作分类单元)，OTUs与总分离物的百分比为，Ⅰ组16.30％、Ⅱ组15.66％、Ⅲ组13.16％、Ⅳ组10.81％、Ⅴ组9.23％、Ⅵ组10.91％；对各组优势OTU进行的ERIC-PCR基因指纹图谱分析的结果表明，Ⅰ～Ⅵ组的Shannon-Wiener指数分别为2.78、2.14、1.78、1.11、0.69、0.31，空白对照组的Margalef指数、Simpson指数、Pieloui指数均明显高于添加药物组，且各种多样性指数随药物浓度的增加而减少。
4、恩诺沙星残留对土壤微生物固氮酶nifH基因分子多样性的影响。通过PCR-RFLP分析了恩诺沙星作用下土壤固氮微生物固氮酶nifH基因的多样性，用药后第35d，Ⅰ～Ⅵ组的OTUs与克隆子的百分比分别为：34.31％、32.18％、26.04％、20.83％、19.09％、20.00％；第70d，Ⅰ～Ⅵ组的OTUs与克隆子的百分比分别为：23.85％、20.75％、18.26％、16.67％、14.58％、11.67％。空白对照组多样性指数均高于添加药物组，第35d，空白对照组的Margalef指数与添加药物各组差异均显著(P<0.05)，第70d，仅与10μg/g和50μg僖两组差异显著；第35d，除了0.01μg/g组，空白对照组的Shannon-Wiener指数与其他添加药物组差异均显著，第70d，仅与10μg/g和50μg/g两组差异显著。由此可见，随着药物作用的时间延长，药物含量0.01～1μg/g组土壤固氮微生物的多样性与空白对照组之间的差异变小。
5、恩诺沙星残留对土壤微生物反硝化酶nosZ基因分子多样性的影响。通过PCR-RFLP分析了恩诺沙星作用下土壤反硝化细菌氧化亚氮还原酶nosZ基因的多样性，用药后第35d，Ⅰ～Ⅵ组的OTUs与克隆子的百分比分别为：48.30％、41.88％、34.78％、33.62％、25.42％、23.81％；第70d，Ⅰ～Ⅵ组的OTUs与克隆子的百分比分别为：29.66％、24.24％、18.10％、16.67％、15.83％、14.39％。空白对照组多样性指数均高于添加药物组，第35d，空白对照组的Margalef指数与添加药物各组差异均显著(P<0.05)，第70d，仅与10μg/g和50μg/g两组差异显著；第35d，除了0.01μg/g组，空白对照组的Shannon-Wiener指数与其他添加药物组差异均显著，第70d，仅与50μg/g组差异显著。由此可见，随着药物作用的时间延长，药物含量0.01～1μg/g组土壤反硝化细菌多样性与空白对照组之间的差异变小。
6、恩诺沙星残留对土壤微生物群落功能多样性的影响。采用BIOLOG检测法比较了不同浓度恩诺沙星影响下的土壤微生物的群落特征，加药组土壤微生物的丰富度指数和多样性指数显著低于空白对照组，且药物浓度越高丰富度和多样性越小。用药后第3d、14d，恩诺沙星含量0.1～100μg/g使土壤微生物群落代谢功能多样性显著降低(P<0.05)；第35d，恩诺沙星含量10～100μg/g使土壤微生物群落代谢功能多样性显著降低。由此可见，随着药物作用的时间延长，药物含量0.01～1μg/g组土壤微生物群落代谢功能多样性与空白对照组之间的差异变小。