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目的:①建立MN9202手性固定相HPLC拆分方法,制备单一对映体,比较MN9202对映体对心肌细胞收缩、舒张功能及钙瞬变的影响,及其对离子通道的立体选择性;②探讨MN9202对心肌的保护作用及其机制。为正确评价MN9202消旋体及其对映体作用的差异性,为二氢吡啶类钙通道拮抗剂的临床应用提供科学依据。方法:①采用Daicel OJ-H手性固定相色谱柱,通过对流动相中正己烷与乙醇的比例、添加三乙胺的量对MN9202对映体的保留时间及分离度的影响进行考察,优化色谱条件,拆分MN9202消旋体。②采用IonOptix单细胞动缘探测系统同步检测MN9202消旋体、S-(-)-MN9202和R-(+)-MN9202作用后心肌细胞收缩、舒张和钙瞬变的变化。③采用全细胞膜片钳方法,比较MN9202消旋体、S-(-)-MN9202和R-(+)-MN9202对心肌细胞L型钙通道电流密度的影响。进而探讨各药物对L型钙通道稳态激活动力学和稳态失活动力学特性的影响。④通过股静脉注射LPS建立感染性休克致动物心肌损伤模型,研究MN9202对心肌的保护作用;RM-6200型四道生理记录仪实时监测血压等参数;用ELISA法测定血浆TNF-α水平;取心肌组织样本,进行HE染色,比较心肌形态学改变。⑤原代培养新生大鼠心肌细胞,用LPS和不同浓度的MN9202消旋体、对映体及氨氯地平作用,采用ELISA法测定培养上清液中TNF-α含量,RT-PCR及免疫荧光法分别测定心肌细胞中TNF-αmRNA和蛋白的表达。⑥RT-PCR和western blot法分别测定LPS刺激不同时间及DHPs作用后心肌细胞iNOS、COX-2 mRNA和蛋白的表达。Western blot法测定磷酸化Akt和总Akt的表达。结果:①本研究建立的MN9202 HPLC手性拆分条件为:Daicel OJ-H手性分析柱,正己烷-乙醇-三乙胺(93︰7︰0.5,V︰V︰V)为流动相,流速为0.5 ml/min,检测波长为237 nm。用此法MN9202对映异构体可达到基线分离,并可少量制备S-(-)-MN9202和R-(+)-MN9202。②不同浓度的MN9202消旋体和S-(-)-MN9202可剂量依赖性抑制大鼠单个心肌细胞的收缩:在1×10-5 mol/l浓度时,百分峰值收缩幅度(PTA %baseline)与对照组相比分别降低了73.8 %和92.7 %;而R-(+)-MN9202则呈剂量依赖性增强心肌细胞的收缩,1×10-5 mol/l时, PTA %baseline升高了18.2 %。MN9202消旋体和S-(-)-MN9202剂量依赖性抑制单个心肌细胞钙瞬变幅度(△FFI)。与对照组相比,1×10-5 mol/l MN9202消旋体和S-(-)-MN9202,细胞钙瞬变分别由0.45±0.04下降到0.07±0.02,及由0.45±0.04下降到0.05±0.01(P<0.01)。而R-(+)-MN9202则增加了钙瞬变幅度:在最大浓度1×10-5 mol/l时,细胞钙瞬变由0.45±0.01升高到0.58±0.05(P<0.01)。③MN9202消旋体剂量依赖性的降低了L型钙通道电流密度。检测电压为0 mV,MN9202浓度为0.03、0.1、0.3、1和3μmol/l时,CaL电流峰值的密度较对照组分别减少了6.7 %、15.0 %(P<0.01)、27.5 %(P<0.01)、50.7 %(P<0.01)和69.5 %(P<0.01);但药物并未改变L型钙通道激活的阈电位(-40 mV)和峰值电流电位(0 mV)。S-(-)-MN9202也抑制了L型钙通道电流密度,检测电压为0 mV时,1μmol/l S-(-)-MN9202使CaL电流峰值的密度从对照组的-9.8±1.0减少到-3.2±0.9(减少了67 %)(P<0.01)。而1μmol/l R-(+)-MN9202则引起了L型钙通道电流密度增加:检测电压为0 mV时,使CaL电流峰值的密度从对照组的-9.3±0.7增加到-10.3±0.6(P<0.01)。MN9202消旋体,S-(-)-MN9202和R-(+)-MN9202均未明显改变L型钙通道的激活特性。但各药物均对通道稳态失活有一定的影响:MN9202消旋体和S-(-)-MN9202均使稳态失活曲线左移,而R-(+)-MN9202使稳态失活曲线轻微右移。④LPS在30 min内引起大鼠平均动脉压的快速下降,从119±4降至85±2 mmHg(P<0.05);60 min后,大鼠平均动脉压仍持续下降,在240 min时为81±3 mmHg。10及30μg/kg MN9202消旋体给药后,延缓了LPS对大鼠平均动脉压的下降。但MN9202的应用并未改变LPS对心率的影响。给予LPS使血浆中TNF-α的水平发生了变化,先升高,至1小时达到峰值,而后逐渐降低。MN9202给药后可使LPS引起的大鼠血浆TNF-α升高的峰值显著降低(P<0.05)。⑤正常心肌细胞几乎不表达TNF-α,但细胞培养液中TNF-α的含量可随LPS浓度的增加而提高;TNF-α的释放与mRNA表达也随着LPS刺激时间的延长而显著升高,在刺激后12小时达高峰。0.1 ~ 10μmol/l的氨氯地平、MN9202消旋体、R-(+)-MN9202对映体可浓度依赖性的抑制LPS刺激的TNF-α的释放和mRNA的表达,S-(-)-MN9202对映体对TNF-α的释放及mRNA的表达无明显影响。1.0μmol/l的氨氯地平、MN9202消旋体、R-(+)-MN9202、S-(-)-MN9202对TNF-α释放的抑制率分别为52.41、31.62、49.81和2.25 %。⑥MN9202消旋体可浓度依赖性地抑制LPS刺激所致iNOS和COX-2转录和翻译水平的表达;1.0μmol/l的MN9202消旋体对COX-2的抑制作用与氨氯地平相当,对iNOS的抑制作用强于氨氯地平;R-(+)-MN9202明显抑制iNOS和COX-2的表达(P<0.05),而S-(-)-MN9202对iNOS和COX-2的表达均无影响。⑦LPS刺激的同时,用MN9202消旋体、R-(+)-MN9202对映体或氨氯地平处理心肌细胞,均可明显增加pAkt的表达(P<0.05);但S-(-)-MN9202对Akt的活化无明显影响。用PI3K抑制剂wortmannin或LY294002预处理2 h后,LPS和DHPs(MN9202消旋体、R-(+)-MN9202对映体和氨氯地平)共处理心肌细胞,各DHPs处理组Akt的活化均受到抑制;3种DHPs类化合物对TNF-α释放的抑制作用均可被wortmannin或LY294002不同程度的降低;Cox-2和iNOS蛋白的表达与无PI3K抑制剂预处理组相比无显著性差异。结论:①本研究建立的手性固定相拆分条件为MN9202单一对映异构体的分离、制备及含量测定等提供了简单、快捷的方法。②两种MN9202对映体对心肌细胞收缩与舒张特性、钙瞬变和L型钙通道均具有立体选择性。S-(-)-MN9202表现出了拮抗特性,而R-(+)-MN9202则具有一定的激动活性。③MN9202对LPS致大鼠心肌损伤有保护作用,此作用与其抑制LPS引起的TNF-α、iNOS和COX-2表达升高密切相关,其中R-(+)-MN9202是抑制炎症相关基因表达的优映体。④MN9202通过激活PI3K,引起下游Akt的活化,参与了TNF-α的调节过程,但对Cox-2和iNOS的调节作用可能依赖于其它信号转导通路。