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H/ACA RNA-蛋白质复合物(RNPs)是一类从古细菌到真核生物高度保守的大分子,它的主要功能是催化核糖体RNA(rRNA)上特定位点的尿嘧啶转化为假尿嘧啶,此外,也参与真核生物核糖体的装配以及脊椎动物端粒的合成。H/ACA RNP由一条能够决定修饰特异性的H/ACA向导RNA以及四个蛋白质Cbf5(在人类中是dyskerin)、Nop10、L7Ae(在真核生物中是Nhp2)和Gar1组成。尽管目前对古细菌复合物的生化和结构研究为古细菌H/ACA RNA-蛋白质复合物的组成方式以及底物催化机制提供了充足的信息,但目前对于真核生物RNP复合物的空间结构和装配方式仍了解甚少。真核生物H/ACA RNP的生物发生需要特异的组装因子Nafl和Shq1参与。Dyskerin(人类的Cbf5蛋白质)发生突变后会引起可遗传的先天性角化不良骨髓缺陷综合症(DC)。在本论文的研究工作中,我们利用X射线晶体学、生物化学以及酵母遗传学等手段研究了S.cerevisiae H/ACA RNP的空间结构以及其生物发生过程。 我们利用重组的酵母H/ACA蛋白质(Cbf5、Nop10、Gar1和Nhp2)以及体外转录的H/ACA RNA,首次在体外组装了具有催化活性的酵母H/ACA复合物,并利用这个体外重组体系深入分析了H/ACA RNP的结构和功能关系。真核生物的H/ACA RNA具有保守的“双发夹”结构,但缺少古细菌H/ACA RNA具有的k-turn结构域。我们证明了RNA“双发夹”结构中的任何一个“单发夹”结构都能在体外与H/ACA蛋白质组分装配成为具有修饰活性的独立结构单元。L7Ae与k-turn结构域的相互作用对于古细菌H/ACA RNP的催化活性是必需的,然而,它的真核生物同源物Nhp2对于RNP的活性却不是必要的,这反映出真核生物H/ACA RNP对于Nhp2结合结构多样的H/ACA向导RNA具有一定的功能适应性.此外,我们解析了分辨率为1.9 A的酵母H/ACA复合物中Cbf5-Nop10-Gar1的三元蛋白质亚复合物的晶体结构,这一结构揭示了真核生物H/ACA RNP一些独有的特征。我们发现酵母的Garl核心结构域具有真核生物特有的C端延伸区域(CTE),它能与Cbf5的突环结构(thumb loop)形成疏水相互作用,从而调控底物的加载与释放。组装因子Naf1在结构上与Gar1同源,它被推测与Gar1结合于Cbf5相同的界面。我们发现用Naf1装配的RNP具有基础催化活性,但由于缺少CTE而不能实现对底物的多轮催化。蛋白质体外竞争实验表明,CTE增加了Gar1与Cbf5的结合亲和力,可能使其能够在H/ACARNP成熟过程中替换组装因子Naf1。 Shq1是参与真核生物H/ACARNP生物发生的保守的组装因子,它由N端CS结构域(含有CHORD结构域蛋白质和Sgtl)和能与Cbf5结合的C端Shq1特异结构域(SSD)组成。近期解析的酵母SSD的结构表明,SSD结构域呈现新颖的螺旋折叠结构。为了了解Shq1-Cbf5相互作用的结构机制,我们解析了分辨率为3.06 A的Shq1 SSD结构域与H/ACA核心蛋白质Cbf5、Nop10、Gar1所形成的四元复合物的晶体结构。这个结构表明SSD主要结合于Cbf5的PUA结构域以及C端延伸区域。并且,Shq1和H/ACA RNA结合于PUA结构域相同的表面,这说明Shq1可能发挥组装分子伴侣的功能,保护Cbf5蛋白质复合物在与H/ACAKNA装配前免于非特异RNA的结合。酵母遗传实验表明能够打破Shq1-Cbf5相互作用的Shq1突变抑制酵母细胞的生长,并且这样的抑制表型在高温下更加剧烈,这表明Shq1能够保护Cbf5蛋白质不在高温下聚合。 Dyskerin(人类的Cbf5)具有真核生物特有的N端和C端延伸,这些区域聚积了很多DC突变位点。我们的酵母Cbf5复合物的结构显示Cbf5的N端延伸在PUA结构域上形成了额外的结构层,它的C端延伸参与Shq1的相互作用.然而,大多数位于PUA结构域的DC突变不分布于Shq1-Cbf5的结合界面上,利用重组蛋白进行的体外结合实验也表明这些突变位点不影响Shq1与Cbf5的相互作用。这些结果对于真核生物Cbf5进化出的延伸结构域提供了功能上的解释,也为DC突变对疾病的影响提供了更为贴切的结构模型。 总而言之,我们的研究结果首次揭示了真核生物H/ACA RNP的空间结构特征,并且为组装因子Shq1的功能和DC突变提供了新的理解。